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《上海海洋大学》 2019年
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Slc24a5和mitfa基因对瓯江彩鲤黑色素形成的调控研究

余陆伟  
【摘要】:黑色素在动物中广泛分布,对生物的伪装、抵抗危害具有重要作用。黑色素细胞在动物中的分布存在多种形态,会形成各种色素图案,尤其在鱼类中较为丰富。瓯江彩鲤(Cyprinus carpio var.color)具有5种基本体色,“大花”、“麻花”和“粉花”中黑色素细胞的分布及发育使其体表形成了大小不一的黑色素斑块。利用瓯江彩鲤研究黑色素细胞形成的机制,为理解黑色素在鱼类中的进化和遗传提供重要参考。本文利用养殖生物学和分子生物学等研究方法,对瓯江彩鲤黑色素的发生及图案生成的过程进行观察,并初步对这一现象发生的分子遗传机制进行了初步探讨,对色素相关基因slc24a5和mitfa的地黑色素形成过程的分子功能进行初步研究。相关研究结果如下:1.黑色素在瓯江彩鲤胚胎和幼鱼时期的发生和分布观察本部分通过对人工授精获得的四种瓯江彩鲤(“大花”、“全红”、“粉花”、“粉玉”)胚胎及幼鱼进行观察,对受精后24小时(24 hpf)、36 hpf、48 hpf三个时期胚胎发育进行观察,主要关注黑色素在胚胎中的发生及发育;以及连续观察胚胎出膜后1天(1 dph)、2 dph、3 dph、5 dph、10 dph、15 dph黑色素在幼鱼身体部分的发生情况。实验结果表明:养殖温度在21℃-23℃时,在36hpf,胚胎首先在眼睛中出现黑色素,“大花”、“全红”、“粉花”的黑色素一致出现在这个时期;养殖温度在25℃,在24hpf“粉玉”眼睛便出现黑色素。黑色素出现在眼睛时,四种瓯江彩鲤胚胎发育形态(嗅囊出现)是一致的。出膜后,连续观察黑色素在胚体上的分布结果发现,在3dph,有黑斑品系身体部分(头部)出现黑色素(少量黑色素细胞);5dph黑色素细胞明显增加,主要分布在鳔、尾鳍基部和头部,躯干部上有少量分布;10dph黑色素细胞继续增加,观察到黑色素细胞成片段化分布;无黑斑品系除眼睛外,始终没有观察到黑色素及黑色素细胞出现。以上研究表明:对比已报导的普通鲤鱼胚胎发育,有黑斑瓯江彩鲤的黑色素的形成较普通鲤鱼数量少且不均,而且出现时期明显推迟。无黑斑品系胚体无黑色素细胞发育和黑色素出现。后期黑色素图案的形成,在幼鱼初期已有雏形。2.slc24a5基因对瓯江彩鲤黑色素形成的调控Slc24a5基因对黑色素在皮肤上的沉积有推迟和减少的功能,能明显地影响动物的色彩。本部分通过分子克隆技术获得了瓯江彩鲤cDNA全长序列2316 bp,其中包括157bp的5’非编码区(UTR)、617bp 3’非编码区(UTR)和1542bp开放阅读框(ORF),编码512个氨基酸。氨基酸序列比对分析表明,瓯江彩鲤slc24a5与其他鱼类的同源性高达75.44%-96.71%,与哺乳动物存在60%以上的同源性,说明该基因在鱼类中具有较高的保守性。荧光定量结果显示,slc24a5基因在有黑色素部分和黑色素出现期有较高的表达量,原位杂交结果表明在黑色素出现部分slc24a5基因表达有明显的表达信号,利用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼slc24a5基因进行敲除造成了黑色素的显著缺失,表明slc24a5基因对黑色素形成的重要调控功能;同时构建瓯江彩鲤slc24a5基因过表达载体,对slc24a5基因敲除斑马鱼进行挽救,结果斑马鱼slc24a5基因突变体表型能够被瓯江彩鲤slc24a5基因挽救,实验表明slc24a5基因结构功能具有高度的保守性,同时表明slc24a5基因的完整结构对黑色素生成具有重要的调控作用。3.mitfa基因对瓯江彩鲤黑色素形成的调控mitfa基因是调控黑色素细胞发生、发育的重要转录因子,该基因的表达能够调控黑色素合成通路基因,从而影响黑色素在动物中的生成。本部分通过分子克隆技术获得四种瓯江彩鲤及普通鲤鱼的mitfa cDNA序列及DNA序列,cDNA序列及编码的氨基酸序列比对结果表明,四种瓯江彩鲤及普通鲤鱼mitfa基因序列核酸变异率低。同时该基因在4种瓯江彩鲤的皮肤组织中的表达量无显著差异;“大花”和“全红”的原位杂交结果表明,该基因在“大花”和“全红”中均有表达。另外从“大花”的不同时期的原位杂交结果中发现,mitfa基因的表达量随着黑色素的在皮肤中增加而增加。本部分结果说明瓯江彩鲤黑色素的发育和生长同其氨基酸序列无关联性,mitfa基因对瓯江彩鲤黑色素细胞的发育和生长有重要的调控作用,但并非是瓯江彩鲤黑色斑块形成的关键因子其对其它色素细胞也存在相应的功能。
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