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《上海海洋大学》 2019年
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猪流行性腹泻病毒(PEDV)膜蛋白互作宿主细胞蛋白的筛选

王瑞阳  
【摘要】:猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪的一种高度接触性肠道传染病,以呕吐、腹泻和食欲下降为病症基本特征,各个年龄猪均易感,带给养猪业巨大的损失。PEDV编码结构蛋白S、E、M、N和16个非结构蛋白。M蛋白是PEDV病毒囊膜蛋白中含量最多的蛋白,参与病毒的组装,并在病毒逃避宿主天然免疫方面发挥重要的作用,但是,目前的研究并不清楚与M蛋白直接作用的宿主蛋白,以及M蛋白是否还具有其他生物特性。因此,这些宿主蛋白的筛选有助于解析病毒的致病机理,并对找出影响病毒复制、装配及与宿主相互作用的靶点,对发展新型的抗病毒药物和疫苗都具有很重要的影响。本研究的研究内容及结果如下:(1)与PEDV M互作的宿主蛋白的筛选方法一:重组质粒瞬时转染筛选猪小肠上皮(IPEC-J2)细胞内与PEDV M蛋白互作的蛋白。构建带有M-APEX2、APEX2基因的重组质粒,并转染至IPEC-J2细胞,通过底物催化抗坏血酸过氧化物酶(APEX2)标记互作蛋白;构建带有M-HA基因的重组质粒,转染至IPEC-J2细胞,以HA标签单克隆抗体进行免疫沉淀(IP)筛选。比较两种方法筛选的结果,基于鉴定蛋白的肽段数的方法分析显示,实验组与对照组相比,鉴定了40个与M蛋白相互作用的细胞内源性蛋白,分别参与不同的代谢通路,选择S100钙结合蛋白A11(S100A11)、蛋白质编码基因(SLC9A3R1)、紧密连接蛋白(CLDN4)、维甲酸诱导基因1蛋白(DDX58)和肽基脯氨酰顺反异构酶D(PPID)为候选蛋白进行验证,同时选择对照组蛋白细胞周期蛋白依赖激酶2(CDKL2)作为阴性对照。方法二:PEDV DR13弱毒株感染筛选非洲绿猴肾(Vero)细胞内与PEDV M相互作用的蛋白。病毒以MOI=0.1感染细胞,使用M单克隆抗体进行IP筛选,质谱分析后,基于鉴定蛋白的肽段数的方法分析显示,感染组与对照组相比,鉴定了62个与M蛋白相互作用的细胞内源性蛋白,分别与蛋白质合成、代谢、细胞信号通路转导等密切相关,选择细胞分裂周期蛋白42(CDC42)、真核翻译起始因子3亚基L蛋白(eIF3L)和G蛋白结合蛋白(RAB11A)为候选蛋白进行验证,同时选择对照组蛋白H2A蛋白组家族成员Y(H2AFY)作为阴性对照。(2)PEDV M与宿主蛋白互作的Co-IP验证:分别构建带有Flag标签和S100A11、SLC9A3R1、CLDN4、DDX58、PPID、CDKL2(阴性对照)、CDC42、eIF3L、RAB11A、H2AFY(阴性对照)基因的重组质粒,同时构建带有HA标签和M基因的重组质粒,共转染至Hela细胞。以Flag单克隆抗体进行Co-IP,以HA标签单克隆抗体进行Western blot,除阴性对照外,均检测到M蛋白条带,结果证实S100A11、SLC9A3R1、CLDN4、DDX58、PPID、CDC42、eIF3L、RAB11A蛋白分别与PEDV M蛋白在细胞内存在相互作用。(3)PEDV M与宿主蛋白互作的共定位验证:分别将带有Flag标签和S100A11、SLC9A3R1、CLDN4、DDX58、PPID、CDKL2(阴性对照)、CDC42、eIF3L、RAB11A、H2AFY(阴性对照)基因的重组质粒,与带有HA标签和M基因的重组质粒,共转染至Hela细胞。以HA和Flag标签单克隆抗体(均1:50稀释)为一抗,488山羊抗鼠(1:200稀释)和647山羊抗兔(7:100稀释)为二抗进行免疫荧光(IFA),结果显示除对照组外,宿主蛋白S100A11、SLC9A3R1、CLDN4、DDX58、PPID、CDC42、eIF3L、RAB11A、AIFM1均与M蛋白共定位。通过以上试验筛选并验证与PEDV M蛋白互作的宿主蛋白,得出结论:鉴定出的PEDV M蛋白能够与宿主细胞蛋白S100A11、SLC9A3R1、CLDN4、DDX58、PPID、CDC42、eIF3L、RAB11A发生相互作用,并鉴定出其他可能与M蛋白发生相互作用的宿主蛋白,本研究为开展PEDV与宿主细胞蛋白相互作用研究提供了重要理论依据。
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