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《上海海洋大学》 2019年
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西里伯斯青鳉(Oryzias Celebensis)生殖细胞标记基因dnd和vasa的表达模式和功能研究

朱天彧  
【摘要】:原始生殖细胞(Primordial germ cell,PGC)是生殖细胞的祖细胞,能够经过分化产生卵子和精子,它为生殖和生育提供了基础。研究表明,在斑马鱼、青鳉、黑鱼以及鲫鱼中,PGCs的数量在性别决定和性别分化中扮演着重要的角色。PGCs的形成、迁移、增殖以及分化实则是由几种保守的母源性的生殖质组分所决定的,包括dazl、dnd、nanos、piwi和vasa等。此外,PGCs的分离和移植介导的“异体生殖技术”为恢复濒危或有价值的鱼类物种提供了有效的方法。因此,研究PGCs的发育对生殖发育理论、种质资源保护和育种应用具有深远的意义,已成为生物生殖领域的研究热点。Dnd是一种高度保守的生殖质组分,在PGCs发育过程中起着重要作用。近年来,dnd基因作为PGCs特化因子首次在日本青鳉中被证实,其表达量决定着PGCs的数量。Vasa则在调控PGCs的形成和迁移的过程中发挥着重要作用。在鱼类中,vasa基因对青鳉PGCs的迁移是必需的,而斑马鱼vasa对PGCs的分化和维持是重要的。因此,dnd和vasa直接作用于PGCs的形成和迁移。西里伯斯青鳉(Oryzias celebensis)是一种淡水鱼,原产于印尼苏拉威西岛(原称西里伯斯岛)和东帝汶的河流湖泊中。西里伯斯青鳉和日本青鳉同属14种鳉属,拥有生长周期短、胚胎透明、繁殖快等特质。西里伯斯青鳉最长可达6厘米左右,约为日本青鳉的两倍,日本青鳉是干细胞和生殖细胞研究的模式生物。到目前为止,西里伯斯青鳉的研究仅限于性别决定系统、性染色体和性别决定位点,然而有关于生殖细胞特异基因的研究几乎没有。本研究通过RACEs克隆得到了西里伯斯青鳉dnd和vasa的全长cDNA序列,随后通过RT-PCR、化学原位杂交和荧光双色原位杂交分析了dnd和vasa在胚胎以及性腺中的表达模式;将dnd/vasa的3’UTR融合荧光蛋白(GFP)构建成gfpdnd/vasa 3’UTR表达载体,利用RNA定点表达技术探究了dnd/vasa 3’UTR标记PGCs的功能及其保守性;通过dnd Morpholino敲降和dnd过表达探索了dnd基因对于PGCs的特化作用;同时使用日本青鳉vasa转基因品系作为供体对于生殖细胞异体移植进行了早期的探索。本实验获得西里伯斯青鳉dnd(Ocdnd)的cDNA整个CDS(Coding Sequence)长为1125bp,编码373个氨基酸(包括终止密码子)。西里伯斯青鳉的vasa(Ocvasa)的cDNA整个CDS长为1848bp,编码615个氨基酸(包括终止密码子)。氨基酸同源比对和系统进化树分结果表达Ocdnd和Ocvasa在进化上高度保守且与日本青鳉同属一支。RT-PCR分析发现Ocdnd和Ocvasa特异的在成体性腺中(精巢和卵巢)表达,在胚胎发育的各个时期都有表达且表达量呈现递减的趋势。在性腺中,化学切片原位杂交显示Ocdnd和Ocvasa的都在早期的生殖细胞中有较高的表达量,且随着两性生殖的生殖细胞的成熟而逐渐降低,但在成熟的精子以及卵母细胞中没有检测到明显的信号。双色荧光切片原位杂交显示Ocdnd和Ocvasa在两性的表达模式极为相似,不能够有效的将两者的表达区分开。在胚胎中,化学原位杂交则显示出Ocdnd和Ocvasa在胚胎发育的早期有较为明显的信号差异。通过双色荧光胚胎原位杂交我们发现:在原肠胚前期,Ocvasa具有一个很广泛的表达或者分布,但是Ocdnd从一细胞开始就定位于种质颗粒中;在原肠胚后期,Ocdnd和Ocvasa同时定位于种质颗粒中。将gfp-Ocdnd/Ocvasa 3’UTR与rfp-Drnos1 3’UTR共同注射到一细胞期的胚胎中,发现无论是Ocdnd还是Ocvasa的3’UTR都能够瞬时标记西里伯斯青鳉自身的PGCs。此外,我们合成了西里伯斯青鳉dnd Morpholino(MOOcdnd)以敲降基因表达,同时利用青鳉的dnd重组表达载体pCSch Oldnd合成mRNA以过表达基因;通过显微注射发现MOOcdnd敲降了基因的表达后会导致PGCs的缺失,而这一现象能够被Oldnd mRNA所挽救,当注射Oldnd mRNA时发现PGCs的数量有了明显的增加。值得注意的是,本实验成功将日本青鳉vasa转基因品系精原细胞移植到生殖细胞缺失的西里伯斯青鳉受体内。Ocdnd和Ocvasa表达模式及部分功能的研究对理解西里伯斯青鳉生殖细胞发生发育具有重要作用,同时也有助于理解Ocdnd和Ocvasa的信号通路,进一步的研究西里伯斯青鳉介导的异体生殖细胞移植奠定了基础。
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:Q953

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