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《上海海洋大学》 2019年
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青鳉(Oryzias latipes)胰岛素样生长因子igf3的克隆和表达模式分析

谢佳乐  
【摘要】:胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors,IGFs)调节脊椎动物的生长、发育、成熟和代谢的过程,同时参与调控细胞的存活、分化。迁移以及细胞增殖的过程。IGFs系统主要包括3个配体(IGF1和IGF2),以及后来发现的IGF3、2个受体(IGF1R和IGF2R)以及6个高度结合蛋白IGFBP1-6。IGF配体需要与结合蛋白结合,通过受体送到生物体内,通过旁分泌、自分泌和内分泌的方式调节生物体内的一系列生物过程。IGF1和IGF2在多种硬骨鱼中有透彻的研究,并且本实验室也有相关报道。IGF1在青鳉性腺的表达模式研究透彻,IGF2在青鳉胚胎发育的功能也有详细的阐述。但是新型配体IGF3的报道仅限于少数几种鱼类。这些相关研究表明了鱼类性腺性腺配体IGF3在硬骨鱼的生长和生殖中发挥很重要的作用。在目前的研究中,IGF3参与斑马鱼的卵母细胞的生长、发育以及成熟的研究较多。同样IGF3调节斑马鱼的精原细胞增殖、分化以及精子的成熟和释放报道较多。但是其他鱼类的IGF的研究较为缺乏。青鳉(Oryzias latipes)是一种生活在稻田的小型淡水鱼,它具有胚胎透明,个体小,易繁殖和完整的基因组序列等一系列特点。此外,青鳉的突变体众多,他的二倍体胚胎肝细胞系、单倍体胚胎肝细胞系都已经建立。而且,青鳉是一个唯一一个拥有雄性和雌性性别决定基因-Dmy和Folx3的个体。在以往的研究中,许多生殖细胞标记基因已经报道,比如dazl、dnd、piwi和vasa等。而且已经建立了转基因品系,比如nanos和vasa,因此青鳉是研究生殖生物学的优良模式物种。此外,很多领先的技术如Morpholino、Talen以及Cas9等在青鳉中已经成功建立,它们为基因的功能研究提供了良好的技术平台。鱼类性腺特异的生长因子igf3只有罗非鱼、斑马鱼、石斑鱼、鲤鱼很少的鱼类中报道。由于igf3的独特的性腺表达,那么在性腺发育中比其他的igfs家族的成员发挥更加重要的作用。使得igf3在其他鱼类中的表达和研究尤为重要。在青鳉中,已经分别开展了igf1和igf2的表达模式和功能研究。本论文克隆了igf3的序列,并进行了序列比对、蛋白结构以及进化树分析。通过RT-PCR和Q-PCR检测其在组织和胚胎中的表达含量,随后利用原位杂交检测在性腺和胚胎的时空表达模式,通过Q-PCR检测了igf3在不同时期卵母细胞的RNA水平。最后,利用荧光原位杂交比较了igf3、igf1以及生殖细胞标记基因vasa在性腺发育过程中的表达模式。本研究获得了igf3的开放阅读框为501 bp,编码166个氨基酸,从蛋白序列分析,igf3有着与igf1和igf2相似的结构,但是进化树上分析却不在同一个进化分支中,证明igf3是igf家族中新的成员。通过RT-PCR和Q-PCR检测发现igf3只在性腺中存在,而且精巢的表达量远远高于卵巢。在胚胎发育阶段,igf3存在于整个发育时期,从2细胞期到小鱼的阶段都有igf3的信号存在。胚胎整体原位杂交显示,在早期的128细胞的分裂球中,igf3的信号就存在,一直到发育七天的性腺中都有igf3的信号。在卵巢中,化学原位杂交显示igf3的信号在卵母细胞发育Ⅰ-Ⅴ期都有表达,而且在成熟时期的Ⅳ-Ⅴ期中的体细胞中也有表达,比如颗粒细胞(granulosa cells)和膜泡细胞(theca cells)。为了比较在卵母细胞中igf3的表达水平高低,Q-PCR检测在卵母细胞发育的Ⅰ-Ⅴ期中,igf3的RNA表达水平呈现上升的趋势,而且在卵母细胞的第Ⅴ期igf3的RNA转录水平达到最高。在精巢中,igf3的信号在早期阶段的精原细胞和精母细胞中没有表达,随着精巢发育,在睾丸间质细胞(Leydig cells)和支持细胞(Sertoli cells)中检测到了igf3的信号。为了更加准确了解igf3的亚细胞定位,我们通过荧光原位杂交比较了igf3和生殖细胞标记基因vasa的表达模式,比较发现在卵原细胞中检测到,其他在卵巢和精巢的表达模式与化学原位杂交的一致。为了更进一步了解igf基因家族的表达模式,我们开展了igf3和igf1共定位研究。在卵巢中,igf3的信号在卵原细胞中存在,但是igf1的信号则缺失。在成熟的第Ⅴ期卵母细胞的中,igf3的信号相对igf1的信号更加强烈。有兴趣的是,igf3和igf1的信号在Ⅳ-Ⅴ期的颗粒细胞和膜泡细胞中交叉相互表达,而且igf3和igf1可以识别二种不同类型的膜泡细胞。在精巢中igf3和igf1在睾丸间质细胞(Leydig cells)和支持细胞(Sertoli cells)。
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:S917.4

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