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《上海海洋大学》 2019年
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缢蛏S型凝集素表达特征及免疫功能研究

白玉麒  
【摘要】:缢蛏(Sinonovacula constricta)是国内重要的经济养殖贝类。但是随着养殖面积的扩大和养殖密度的增加,养殖环境不断恶化,缢蛏养殖过程中死亡现象日趋严重。与其它无脊椎动物一样,贝类缺乏免疫球蛋白,仅依靠先天免疫机制识别微生物病原体,其中包括细胞和体液免疫。生产中遇到的问题促使研究人员对贝类先天免疫的研究。有报道生物先天免疫通过相关受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别微生物独有病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),来激活免疫应答。近年来,有许多报道称半乳糖凝集素作为模式识别受体参与先天免疫,并且逐渐发现了生物体中的各种作用。在这项研究中,克隆了两个来自缢蛏中的半乳糖凝集素基因,这些基因参与识别和清理入侵微生物,在贝类免疫中起关键作用。1.两个半乳糖凝集素的cDNA全长克隆及序列分析从本实验室之前的缢蛏转录组数据中获得了2个半乳糖凝集素基因ScGal-1和ScGal-2的不完整片段,验证其准确性后通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得了这两条基因的cDNA全长序列。ScGal-1基因全长1066bp,包含长度为531bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),编码176个氨基酸,预测分子量为19.77kDa;ScGal-2基因全长1309bp,包含长度为507bp的开放阅读框,编码168个氨基酸,预测分子量为19.49kDa。两基因的预测结构域都含有C端碳水化合物识别结构域(carbohydrate recognition domain,CRD),并且在N端存在二聚化界面残基,信号肽预测分析都没有发现经典分泌信号肽。2.基因的组织表达及细菌感染后表达模式分析通过qRT-PCR检测了缢蛏S型凝集素ScGal-1和ScGal-2在健康缢蛏7个组织以及不同细菌感染后不同时间点在血淋巴中的表达情况。分析结果表明,ScGal-1在血淋巴中的表达量最高其次是鳃,均显著高于其他组织(P0.05);ScGal-2在血淋巴和肝胰腺中的表达量具有显著性(P0.05)。血淋巴和肝胰腺是典型的免疫器官,而鳃是抵御外来微生物的第一道防线,在这些组织中的显著表达暗示其与免疫的密切联系。在金黄色葡萄球菌和鳗弧菌感染后的数小时内,ScGal-1和ScGal-2表达量表现出不同的应答变化,ScGal-1在金黄色葡萄球菌攻毒后12小时表达量达到峰值(3倍),在鳗弧菌攻毒后上调较缓72小时达到峰值(3倍);ScGal-2在金黄色葡萄球菌攻毒后没有显著性变化,而在鳗弧菌攻毒后24小时达到峰值(3倍)。两个基因在细菌攻毒后均经过应激下调变化后对细菌表现出免疫应答急剧上调,体现两条基因均为缢蛏免疫相关基因,而对不同细菌的不同调节模式说明两条基因可能存在不同的反应机制。3.基因的重组蛋白表达及功能验证由原核表达得到了两个基因的重组蛋白rScGal-1和rScGal-2,并研究了重组蛋白的凝菌活性、结合糖类的能力以及促进血细胞吞噬作用的能力。rScGal-1对所选三种革兰氏阳性菌和阴性菌均发生结合并凝集,对不同糖类结合能力研究表明其对肽聚糖(peptidoglycan,PGN)有较强的结合能力,显著促进血细胞的吞噬作用;rScGal-2对所选三种革兰氏阳性菌的结合以及凝集能力要明显弱于三种阴性细菌,对不同糖类的结合能力进行研究,表现出对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)明显的亲和性,该基因促进血细胞对两种菌的吞噬能力,其中对革兰氏阴性细菌的促吞噬更为显著。两种基因对所选细菌表现出不同功能差异取决于对细菌表面物质的结合能力,PGN约占革兰氏阳性细菌干重的50%,占革兰氏阴性细菌干重约10%;LPS则是革兰氏阴性细菌的独有组分。该结果表明ScGal基因是重要的免疫基因,通过其CRD识别独有的分子结构来发挥免疫作用。
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