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《上海海洋大学》 2019年
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基于脱氧核酶的铅离子高灵敏荧光传感体系构建及性能研究

陆云飞  
【摘要】:随着人类社会工业化进程的不断推进,工业生产活动导致了大量的金属铅以离子形态排放到人类赖以生存的自然环境中,加剧了环境污染并对人类身心健康产生严重威胁,铅污染问题已经成为人们日常关注的焦点。然而一些传统检测重金属离子的手段已经难以满足日常生活中监测环境污染、保障食品安全的迫切需求,因此,构建新型高灵敏的铅离子传感器具有重要的理论与现实意义。脱氧核酶是一类采用体外分子进化技术经过人工筛选再合成的功能性寡核苷酸片段,其具有高效的催化特性和优异的结构识别能力,并且脱氧核酶还具有选择特异性好、生物稳定性优越、易合成、易修饰等优势特点,它已成为研究人员构建高灵敏度和高选择性重金属离子生物传感器时所常采用的重要识别元件。目前,基于脱氧核酶所构建的生物探针通常采用荧光法、比色法和电化学方法作为基本的设计思路。其中,采用荧光法构建的核酸探针不但具有灵敏度高、特异性好、操作简单、生物相容性好且便于携带,能够在较低程度损伤情况下实现在活细胞内进行高分辨成像等实用性优势,在生物探针构建中得到了更为广泛的应用。目前,基于脱氧核酶构建的检测铅离子的荧光探针已经取得了很大的进步,但是构建高灵敏度、高选择性、快速检测且环境友好的荧光生物探针仍是一个重大的挑战。本研究采用脱氧核酶作为识别元件通过了两种不同的设计思路:寻找高量子产率的新型荧光基团以及核酸链级联放大,构建了两种新型荧光探针,实现了对痕量Pb~(2+)的高灵敏检测,主要的研究内容如下:(1)选用了一种从天然海藻中提取的具有很高量子产率的荧光蛋白R-藻红蛋白作为探针的荧光基团,其荧光强度是同等浓度下荧光素的30~100倍。同时,利用GR-5脱氧核酶对Pb~(2+)的特异性识别能力,将其作为该荧光探针的识别元件。基于荧光共振能量转移的基本原理,构建了一种可用于痕量铅离子检测的高灵敏度、高选择性且绿色环保的荧光探针DNAzyme-R-PE。该荧光探针的线性检测范围为0.5~75 nM,最低检测限约为0.16 nM。同时,由于该荧光探针的制备原材料绿色环保,不会对检测环境造成二次污染。因此,本文开发的DNAzyme-R-PE荧光探针有望成为饮用水质量检测评估的一种有力工具。该荧光探针具有较好的耐生物酶切的能力,在10%的FBS中表现出良好生物稳定性的同时基本保持了荧光探针的检测性能。因此,荧光探针DNAzyme-R-PE未来有望应用于活体生物体内铅离子的检测。(2)基于GR-5脱氧核酶对Pb~(2+)的特异性识别能力构建了一种高灵敏度、高选择性的痕量铅离子检测方法。Pb~(2+)切割GR-5脱氧核酶得到的寡核苷酸链,在DNA聚合酶BSM和DNA剪切酶Nt.BbvCI的共同作用下,通过等温扩增的方式大量扩增特定产物核酸链,能够形成结构稳定的G-四联体,再与锌原卟啉相结合,引起荧光信号强度的变化,并随着铅离子浓度的增加,荧光强度逐渐增加。将链置换扩增技术(SDA)和指数放大反应(EXPAR)相结合通过双重循环放大实现对Pb~(2+)的高灵敏荧光检测。该荧光探针的线性检测范围为0.1~50 nM,最低检测浓度约为0.03 nM。该方法成功应用于复杂实际水样中Pb~(2+)的检测并有望在饮用水内痕量铅离子的检测中发挥重要作用。本研究中所构建的两种荧光探针都具有很高的灵敏度、优异的特异性优于同类型荧光探针、线性检测范围宽以及绿色环保不产生二次污染等特点,并且成功应用于实际样品检测。
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R123.1;O657.3

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