半滑舌鳎伪雄鱼性别相关标记和基因的鉴定和应用

【摘要】：半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)作为一种市场价值较高的海水鱼,是我国沿海地区,特别是北方沿海地区养殖普及率较高的经济种。驯化近20年来,养殖规模呈稳定扩大的趋势。同时,半滑舌鳎是比目鱼类中,性别二态性程度最高的物种之一,雌鱼相对于雄鱼具有绝对的生长优势。事实上,由于雄鱼的市场价值极低,生产中,往往只会选择性保留少部分雄鱼作为种鱼进行繁殖,其余会尽早的淘汰。因而,培育全雌或者高雌的半滑舌鳎苗种,是广大科技工作者和养殖技术人员的育种方向之一。在自然条件及养殖生产实践中,我们知道普遍存在半滑舌鳎伪雄鱼。后者作为一种生理性别和遗传性别不统一的“中性”鱼,可能是造成半滑舌鳎群体性别比例的原因。早前的研究发现,伪雄鱼作为父本产生的后代更趋向于成为伪雄鱼。这打破了正常1:1的性别比例,使生理性别雄鱼在后代中不断积累,比例越来越高。实际生产中,这个比例甚至达到80%以上,这对半滑舌鳎养殖业是一个很大的冲击,造成养殖效益逐年下降。因此,通过人工挑选繁育亲本而控制半滑舌鳎性别比例是近几年被广泛开展的养殖技术服务工作。伪雄鱼的识别已经摆脱了单纯肉眼观察的初级阶段,通过开发的性别特异分子标记,可以有效的进行半滑舌鳎遗传性别的判定。半滑舌鳎性别标记随着分子生物学技术的进展也在与时俱进,从AFLP标记,到微卫星标记,再到后来的SNP和Indel标记,技术上在不断的进步。本文在整理总结前人研究的基础上,利用当下分子生物学,特别是基因组学工具,进一步丰富和完善半滑舌鳎伪雄鱼性别鉴定相关研究,从新的技术方法和研究对象着手,通过对半滑舌鳎全基因组扫描,挖掘半滑舌鳎伪雄鱼性别相关的关键基因和标记,同时,在标记的挖掘过程中,对半滑舌鳎性别标记背后的机制因素做初步的探讨,为解构半滑舌鳎性别决定机制,特别是半滑舌鳎伪雄鱼产生和跨代遗传的机制提供一些新的思路和理论支撑。本论文完成的具体工作内容如下:1.基于半滑舌鳎基因组性染色体信息,通过生物信息学的方式,开发和验证了两个Indel标记和两个SNP分子标记。其中Indel标记较前人开发的标记具有分辨率更高的呈现效果和更低的琼脂糖制备浓度,从而更好的节约了检测时间,降低了检测人力成本。我们将通过基因组性染色体的比对筛选验证到的一个indel标记,利用重组酶等温扩增体系RAA和侧向层析LFD系统相结合,把传统的PCR和琼脂糖电泳检测场景优化,开发了用于半滑舌鳎性别鉴定的RAA-LFD检测试纸条。这也是目前第一个用于鱼类性别鉴定的快速检测试纸。该试剂条可在常规温度条件下(通常为37℃),30min,以样品DNA为模板,实现对目的基因片段的扩增检测和可视化呈现,与传统indel标记比较,一致性达到100%。2.将半滑舌鳎不同性别群体进行了考察性别为基础的GBS简并测序。把性别作为考量性状进行GWAS分析,从而挖掘到了多个性别相关SNPs和一个性别相关的基因。半滑舌鳎的Z染色体上捕获了8个有效的snp可以进行性别鉴定。多位点反应系统将提供更好的准确度和较高的累积排斥率,同时,我们在半滑舌鳎雌雄鱼基因组上进行扫描,首次发现一个性别相关基因prdm6基因,这个基因是组蛋白甲基化转移酶基因,其主要作用是在表观水平调节组蛋白赖氨酸甲基化转移,其在半滑舌鳎不同性别的性腺中有差异表达,在雄性中的表达显著高于伪雄性和雌性,提示我们组蛋白甲基化可能和半滑舌鳎性别的分化和伪雄鱼的发生相关。3.首次在半滑舌鳎精液中分离鉴定到了外泌体。这是第一次从鱼类精液中提取到外泌体。通过透射电镜观察、粒径示踪分析和免疫印迹的方法证明了外泌体的存在。同时利用高通量测序的方法,分析了半滑舌鳎雄鱼和伪雄鱼精浆外泌体内的差异small RNAs,通过筛选验证,开发到了4个mi RNAs和6个pi RNAs作为理想的生物标志物,可以有效地区别半滑舌鳎雄鱼和伪雄鱼。同时,通过靶基因预测分析,发现这4个micro RNAs的靶基因均与卵巢的发育和维持相关,为后续探讨小RNA调控半滑舌鳎性别奠定了基础。我们筛选到的标志性pi RNAs:pi R-mmu-6643660,pi R-mmu-32360528,pi R-mmu-72274,pi R-mmu-31018127,pi R-mmu-29271668和pi R-xtr-979116均在半滑舌鳎雄性供体中高表达,但在伪雄鱼中表达很低。在6个pi RNAs中,前4个pi RNAs通过靶基因预测与性发育和甲基化有关,后2个信号仅与性发育有关。目前,6个pi RNA在包括鱼类在内的所有物种中的功能尚不清楚,这表明应进一步研究这些pi RNA在与靶标相互作用过程中的调控机制。