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基于直立碳纳米管阵列和主客体识别的生物传感器研究

杨丽珠  
【摘要】:DNA研究是生命科学领域中极为重要的内容,而对特定DNA序列定量检测在疾病诊断、法医鉴定、生化战争预防、环境监测和生物工程等领域有着十分重要的意义,尤其是对疾病的早期准确诊断及治疗有着举足轻重的意义。在种类繁多的基因检测技术中,基于特异性碱基互补原理而构建的DNA生物传感技术,正为许多研究者所重视。其中,DNA电化学生物传感器是一门涉及电化学、生物化学、临床医学及电子科技等领域的交叉学科。目前,电化学DNA检测方法因其价廉、快速、灵敏、特异性、操作简单和方便携带等优点,被研究者认为是最有发展前景的一类DNA分析方法,正受到越来越多的广泛的关注,已成为当今生物学、医学领域的前沿性研究课题。 碳纳米管作为一种新型的碳纳米材料,具有导电性好,比表面积大,化学稳定性好,机械强度高等优良的特性。由于其独特的结构和物理性能,碳纳米管已经被广泛的研究,并期待将来在很多潜在的应用方面引起更多的关注。直立碳纳米管阵列作为多壁碳纳米管中的一种,与杂乱无章的碳纳米管相比,在导电性和比表面积等方面具有更为突出的优势,由此,它作为一种理想的电极材料已经在生物传感器领域有了广泛的应用。直立碳纳米管的较大的表面积有利于固定更多DNA和蛋白质等生物分子,同时,功能化的直立碳纳米管阵列可以通过键合作用固定生物分子,可以提高稳定性。因此,直立碳纳米管在电化学分析,特别是生物电化学分析研究领域具有广泛的应用前景。 超分子化学是一门研究分子间通过非共价键相互作用而形成的分子聚集体的化学学科,随着与医药科学、生命生物科学、信息科学、纳米材料科学的交叉融合,超分子化学已发展为应用范围广泛的超分子科学。分子识别技术,又称主客体识别技术,被定义为超分子的“主体”分子和“客体”分子之间的非共价连接作用,在化学传感领域等发挥了非常重要的作用。主客体识别就是对客体选择性结合并产生特定功能的过程,它是酶的催化、核酸的表达、抗体与抗原、药物与靶分子相互作用等生物识别的根基。环糊精和瓜环作为两类典型的超分子识别个体中的重要主体化合物,以其独特的识别性质受到广泛的关注。对它们的研究从主客体识别形成包合物的机理已经转移到对其在分析化学、医药制备、环境检测和生物传感器等领域的应用研究。 本论文主要的研究内容为将实验室合成的直立碳纳米管阵列应用于电化学和电致化学发光生物传感器的研究,以及基于主客体识别技术的非固定化探针的溶液中均相杂交的DNA生物传感器的研制。主要包括将Cu2+-DNA复合物固定到直立碳纳米管阵列电极上构建灵敏的无酶型的过氧化氢传感器;利用直立碳纳米管阵列同时固定DNA和吸附媒介体的双修饰作用,构建基于酶放大作用的电化学DNA生物传感器;基于CdS量子点/直立碳纳米管阵列构建无标记型的电致化学发光核酸适配体生物传感器;利用直立碳纳米管阵列和环糊精构建两种不同类型的基于主客体识别技术的非固定化的均相杂交的DNA传感器;构建以瓜环为主体分子的基于主客体识别技术的DNA生物传感器。这些传感器具有灵敏度高,特异性好,稳定性好以及制备简单等特点,能够成功地应用于对特定DNA序列的选择性测定和对目标蛋白质的特异性识别,为基因和蛋白质的检测分析提供了简单、便捷和廉价的新理念。 本论文总共分为七章。 第一章绪论 本章首先系统介绍了直立碳纳米管阵列及其应用,包括碳纳米管的分类和性能、直立碳纳米管阵列的制备方法、以及直立碳纳米管阵列在生物传感器领域的应用现状。其次介绍了电化学传感器的概况及其研究现状,重点介绍了电化学DNA传感器的原理,分类以及研究现状。接着,介绍了电致化学发光生物传感器的原理及其应用,包括电致化学发光体、发光原理以及核酸适配体生物传感器的研究现状。最后,介绍了主客体识别技术及其在生物传感器领域的应用概况。基于这些研究内容,提出了本论文的研究目的和意义。 第二章一种灵敏的无酶型的DNA-Cu2+/ACNTs过氧化氢传感器的研制 我们通过实验室技术制备直立碳纳米管阵列(ACNTs)电极,构建了一种新型灵敏的无酶型过氧化氢传感器。利用化学气相沉积法制备ACNTs,制成ACNTs电极,通过在ACNTs电极表面电沉积DNA-Cu2+复制备成DNA-Cu2+/ACNTs电极,作为无酶型的传感器用于测定H202的含量。循环伏安图显示有一对明显的氧化还原峰,来源于Cu2+/Cu+。同时,电沉积DNA-Cu2+复合物对检测H202有很好的电催化行为和很高的稳定性。为了使DNA-Cu2+/ACNTs电极对H202的测定具有更高的灵敏度,我们优化了实验参数。包括Cu2+浓度,电沉积时间和缓冲底液的pH值等。在选定的最佳参数条件下,H202的含量在2.0×10-7M到2.0×10-3M范围内呈线性关系,灵敏度高达-46.46μA mM-1。测得最低检测限为8.0×10-8M,响应时间在4s内。同时,该传感器具有干扰小,重现性好和稳定性高等优点。 第三章基于酶放大作用的直立碳纳米管电化学DNA生物传感器的研制 我们研制了基于辣根过氧化酶(HRP)标记和硫堇作为电子媒介体的直立碳纳米管阵列生物传感器,应用于放大测定人类SARS病毒的DNA序列。首先,捕获探针5’-端修饰的巯基和ACNTs表面覆盖的金通过自组装固定到ACNTs电极上。然后,相继与目标DNA和另一段HRP--标记的检测DNA杂交反应后,HRP-寡核苷酸杂交物固定到了ACNTs表面。接着,硫堇作为HRP的电子媒介体,通过和ACNTs的π-π共轭作用吸附到电极的表面。制备成的基于酶的ACNTs生物传感器对H202表现出很好的催化还原活性,并可以利用该生物传感器来测定目标DNA。我们用循环伏安法和计时电流法研究基于酶放大的生物传感器的特征。在选定的优化条件下,DNA浓度在1.0×10-12M到1.0×10-9M的范围内呈线性关系,检测限为1.0×10-13M。此外,该生物传感器具有响应快、稳定性高,特异性好和灵敏度高等优点。 第四章基于CdS量子点值立碳纳米管电极的电致化学发光适配体生物传感器检测凝血酶 我们制备了基于CdS量子点/直立碳纳米管阵列(CdS QDs/ACNTs)电极的无标记的适配体传感器,并应用于灵敏检测凝血酶。CdS QDs和壳聚糖(CTS)复合物膜通过电沉积CTS-CdS QDs胶体溶液固定到ACNTs电极表面。该电极显示很强的电致化学发光(ECL)和很好的生物兼容性。当氨基修饰适配体(aptamer)通过戊二醛连接到电极表面,由此修饰的电极可以作为ECL适配体传感器用于凝血酶的检测。凝血酶和适配体的特异性反应导致ECL发光强度的下降,ECL强度的变化值和凝血酶的浓度在1.0×10-13 M到1.0×10-9M的范围内呈线性关系。该ECL适配体传感器具有快速、灵敏度高、特异性好和稳定性好等优点,作为蛋白质的检测方法具有很好的应用前景。 第五章基于主客体识别的非固定化水相直接杂交的电化学DNA识别 我们利用电化学方法电聚合p-环糊精(p-CD)修饰ACNTs电极,并将制得的聚β-CD/ACNTs制备成电化学DNA生物传感器,实现通过主客体识别技术实现非固定化的溶液直接杂交的电化学DNA识别。方法为了实现均相溶液的杂交,4-(对二甲氨基偶氮苯)苯甲酸(dabcyl)标记的DNA探针和目标DNA在溶液中杂交生成dsDNA的杂交物。当聚β-CD/ACNTs电极浸入dabcyl标记的DNA探针或dsDNA的杂交物时,由于电极上的β-CD和dabcyl分子之间存在主客体识别作用,dabcyl标记的DNA探针或dsDNA杂交物被聚β-CD/ACNTs电极捕获。然后,以嵌入剂作为杂交指示剂对DNA的杂交进行检测。我们对不同的捕获电极和不同的嵌入剂进行了选择。聚β-CD/ACNTs电极作为捕获电极和道诺霉素作为嵌入剂,在选定的检测条件下,方法具有较高的灵敏度,最低检测限为6.0×10-13M,同时该传感器显示很好的特异性。 第六章β-环糊精衍生物功能化修饰直立碳纳米管阵列及其通过主客体识别应用于电化学DNA传感 我们通过重氮化反应,在ACNTs上功能化修饰p-CD衍生物,通过β-CD/ACNTs电极的主客体识别技术实现在均相溶液中DNA的杂交检测。实验设计了一种具有茎环结构且两端都进行修饰的特殊探针(DLP)。DLP的一端修饰作为β-CD的客体分子的dabcyl;另一端修饰作为电化学标记物的CdS纳米颗粒,用来检测DNA杂交信号。如果没有目标DNA, DLP在溶液中保持其发夹结构不能被β-CD/ACNTs电极捕获。而当有互补的目标DNA存在时,DLP的发卡结构就“打开”与目标DNA形成直链型的双链DNA分子(dsDNA),β-CD/ACNTs电极就可以捕获dsDNA分子通过p-CD和dabcyl的主客体识别作用。CdS纳米颗粒-dsDNA/β-CD/ACNTs的电化学信号可以检测。在选定最优条件下,该方法对目标DNA的检测具有高的灵敏度和特异性,最低检测限为5.0×10-13 M。 第七章基于瓜环为主体的主客体识别DNA生物传感器的研究 我们制备了一种新的七元瓜环修饰多壁碳纳米管(Q7/MWNTs)电极,利用主客体识别技术实现均相溶液中DNA的杂交检测。本实验仍然采用双修饰的DNA探针(DLP), DLP的一端标记了dabcyl作为Q7的客体分子,另一端修饰上CdTe量子点。杂交反应之前,DLP保持其茎环结构,由于dabcyl分子和CdTe量子点的空间位阻效应,使得dabcyl分子难以被Q7/MWNTs电极上的Q7分子所捕获。当DLP和目标DNA发生杂交反应时,DLP的茎环结构就会“打开”形成直链型的结构(dsDNA),此时,dabcyl分子可以通过主客体识别作用顺利进入Q7/MWNTs电极表面的Q7的空腔中,从而被修饰电极所捕获。通过检测捕获至修饰电极表面的CdTe的电化学信号,可实现均相溶液中DNA的杂交检测。在选定的最佳条件下,该方法对目标DNA的检测具有高的灵敏度和特异性,最低检测限为7.0×10-13M。


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