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《华东师范大学》 2012年
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藏狐群体棘球绦虫感染率的流行病学研究

蒋韦斌  
【摘要】:泡球蚴病(alveolar echinococcosis, AE)是一种由多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis, Em)引起的分布广泛、危害严重的人兽共患寄生虫病,是我国高原牧区最重要的公共卫生安全问题之一。青藏高原东部牧区是世界上最严重的疫区,在当地分布着三种棘球绦虫(Echinococcus),分别是细粒棘球绦虫(Egranulosus, Eg)、多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫(E. shiquicus, Es)。 藏狐(Vulpes ferrilata)和家犬是当地Em主要的终末宿主,而藏狐还被证明是Es的终末宿主。由于家犬与人之间的密切关系,现有研究主要集中在家犬传播AE的途径上。但事实上,零星的报道显示野生狐属动物Em的感染率是已知Em终末宿主中最高的,至少是家犬的2至3倍,达44%以上。因此,在我国棘球蚴病的研究中,不应该忽略狐狸这种高感染率的野生保虫宿主。只有充分了解Em在野生动物和家养动物中的传播机制,才能真正实现我国西部牧区棘球蚴病的综合有效防治。 本研究以青藏高原东部地区采集的狐粪为研究对象来评估当地藏狐的粪便感染率。我们在四川省石渠县云波沟分两次共采集到了229个疑似狐狸粪便样品,由于采样地同域分布着藏狐和赤狐两种狐狸,其粪便形态难以区分,我们先将其全部采回,后在实验室工作中利用分子手段将其区分开。其中2009年8月采集到的45个粪样和实验室保存的28只藏狐及2只赤狐样本被用来建立分子手段的物种鉴定法,鉴定粪便来源的物种;2010年7月至8月采集到粪样184份被用于检测当地狐狸粪样的棘球绦虫感染率。主要研究结果如下: 1.30个已知狐种的组织样本的线粒体细胞色素b (Cytb)基因片段的测序结果显示两种狐狸在该同源序列上最大差异率达到了11%。根据28个藏狐组织样品中测得的8种单倍型(GU724772-GU724779)和检索到的8种赤狐的单倍型,我们使用软件Primer Premier5.0选择合适的限制性酶切位点来区分两种狐狸。内切酶BamHI能特异酶切藏狐序列片段的145和358位点,而赤狐DNA片段上没有任何BamHI的酶切位点;内切酶SspI能特异酶切赤狐序列的121和264位点,而藏狐DNA片段上没有任何SspI的酶切位点。通过本试验建立的线粒体cytb基因片段的PCR-RFLP方法对30个已知来源的组织样本酶切分析,得到了和预期一样的结果,表明该基因片段上的酶切位点均具有高度的种内保守性和种间特异性。 2.使用酚/氯仿抽提法,Chelex-100煮沸法和商业试剂盒改良法分别提取粪便DNA。结果显示酚/氯仿抽提法不能从狐狸粪便中提取到较为完整的基因组DNA且扩增不出Cytb基因片段;Chelex-100煮沸法提取的粪便DNA降解比较严重,较新鲜的样本也呈明显的“拖尾”现象,但能扩增出Cytb特异片段;商业试剂盒改良法操作简单,用时较短,去除粪便中的抑制剂效果较好。采用这种方法从新鲜粪便和较老的粪便中提取的基因组DNA都比较完整,PCR扩增产物经测序比对与藏狐Cytb基因片段同源性一致,粪便DNA的提取效果最好。灵敏度分析显示粪样PCR能扩增到Cytb基因片段的最低DNA模板浓度为0.1%,而酶切反应检测所需的最低DNA模板浓度为1%。 3.45个粪样中成功提取到36个粪便DNA,通过限制性酶切发现,其中29个粪样来源于藏狐;7个来源于赤狐,剩余9个粪样未能扩增到目的产物。我们使用F检验对阳性样品和阴性样品和DNA浓度进行比较发现阳性样品DNA浓度为15.45±5.10ng/μL(±SD,n=9)显著高于阴性样本的DNA浓度9.05±3.95ng/μL(±SD,n=9)(F=8.848,P=0.009)。 4.对于这9个阴性样本,我们对其PCR抑制剂的含量做了进一步分析。其中五个样品都是较老的粪样,表面腐烂,在野外收集时其中的粪便DNA和抑制剂可能都已经降解了。另外4个粪便存在大量抑制剂,结果显示0.4μl的狐粪DNA中所含的抑制剂能导致至少2ng模板DNA的扩增失败。 5.在进行粪样中棘球绦虫感染率检测前,我们使用了4种不同的漂浮液浮集、筛网过滤和双层灭菌纱布过滤三种方法来比较粪样中棘球绦虫虫卵的富集效果。结果表明漂浮液中硝酸铅溶液的浮集效果最好,阳性检出率达到了100%,但杂质较多,虫卵易变形。筛网过滤的检出率只为40%。双层灭菌纱布过滤的阳性检出率也达到了100%,虫卵未见变形,清晰易辨,富集效果较好。采用组织破碎仪5500r/m,15s振荡两次可机械破碎绦虫坚厚的胚膜来释放其中的DNA。 6.从184份粪样中随机选取72份样品来评价所建立的粪便DNA双重巢式PCR诊断方法,成功提取到其中的48份样本DNA且全部来自藏狐。用双重巢式PCR和PCR-RFLP两种方法分别筛查狐粪中存在的Em和Es遗传物质,发现两种方法的检测结果存在显著差异。48个粪样中,双重巢式PCR共检测到23(48%)个存在棘球绦虫感染,包括9(19%)个样品感染Em,20(42%)个样品感染Es,其中6(12.5%)个存在双重感染现象。而PCR-RFLP检测到3(6%)个样品感染感染Em,4(8%)个样品感染Es,没有发现双重感染现象。所有在PCR-RFLP方法中检测到呈阳性的样本均在双重巢式PCR中得到确认。此外,检测到6个Em的单倍型,其中三个是首次发现(Accession No.JN706738-JN706740),还检测到5个Es的单倍型,其中JN706741是首次发现的。 7.在所有184份样本中,我们共检测到120份粪样来源于藏狐,6份来自赤狐。藏狐粪样中74个(62%)检测到存在棘球绦虫感染,但没有发现存在Eg感染。其中23个(19%)单一扩增到Em的特异条带,32个(27%)单一扩增到Es的特异条带,19个(16%)扩增到两种虫的特异条带,存在Em和Es双重感染现象。用ZfX/Y和Sry引物对藏狐粪样进行性别鉴定,94个成功扩增到特异条带。我们发现51个粪样来自雄性个体,43个来自雌性个体,没有显著偏离1:1的性比(χ2=0.341,P=0.559),在不同性别藏狐间没有发现两种棘球绦虫感染率的显著差异。6个赤狐粪样中没有发现存在Eg或Es感染,但有2个感染Em。对于粪样来源个体的性别鉴定,5个成功扩增到特异条带,其中1个粪样来自雄性个体,4个来自雌性个体。
【学位授予单位】:华东师范大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S858.92

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