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《华东师范大学》 2012年
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生化样品的微流控芯片在线富集及检测研究

汪志芳  
【摘要】:微流控芯片(MCE)具有分析速度快、样品消耗少、以及具有将多步分析过程一体化和自动化的优点,已经在生物化学、医学检验、药物筛选、环境监测等领域得到了广泛的应用。然而,由于进样体积少、光程距离较短,检测灵敏度不足以满足低浓度样品的分析需要。但是在微流控芯片上通过增加光程距离来提高灵敏度是无法可行的,增加光程距离就意味着增加微流控芯片通道的深度,而这对于微流控芯片构造来说是比较困难的事。因此,在线富集浓缩技术是改善微流控芯片灵敏度行之有效的一个方法。 在过去的几十年里,一些科研工作者已经将毛细管电泳技术用于细菌分析,本论文的研究工作主要在前人细菌电泳分析研究工作的基础上,利用微流控-激光诱导荧光检测系统用于细菌分析并针对细菌在电场下的吸附和聚集现象做了 一些研究。在此研究的基础上进一步利用在线富集技术提高检测分析灵敏度,实现了样品中低浓度微生物的分析。具体研究内容如下:第一部分:微流控芯片电泳-激光诱导荧光用于益生菌胶囊中微生物的检测本文利用微流控芯片电泳-激光诱导荧光联用技术实现了双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌的快速分离与检测。在pH值为8.5的Tris-硼砂-EDTA-环氧乙烷缓冲液中四种益生菌能够在150s内达到有效分离。其中环氧乙烷(PEO)能够大大降低微通道内壁对细菌的吸附。在pH为8.5的缓冲液中益生菌表面均带有负电荷,有助于电泳分离。此方法具有样品用量少、分析时间短、仪器设备简单、分析结果准确可靠等优点,可用于药物中益生菌的鉴定及分离。 第二部分:脂纳米颗粒用于细菌的微流控电泳分析 细菌的聚集和吸附严重干扰了其电泳分离的定性和定量。在此文的研究中,脂纳米颗粒作为拟稳态相用于抑制细菌在通道内的聚集和吸附。含有脂纳米颗粒4.5mM的TBE作为运行缓冲,利用微流控芯片-激光诱导荧光系统分离检测保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌。文中讨论了脂纳米颗粒抑制细菌聚集和吸附的机理,zeta电位的实验测定结果佐证了这个机理。在最佳的实验条件下,三种菌被分离鉴定。使用脂纳米颗粒作为缓冲添加剂的微流控电泳分析方法也被成功用于酸奶样品中细菌的分离与鉴定。 第三部分:通过在线富集技术在微流控芯片上实现低浓度细菌微生物超灵敏检测 本文通过将壳聚糖(CS)扫集,反转电场堆积和场放大样品堆积多步浓缩方法联合,在芯片上实现了细菌的高效检测。大肠杆菌被用来研究多步浓缩方法的性能。壳聚糖作为芯片电泳的最有效扫集试剂,可取代常用于电泳过程中的扫集试剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。在运行缓冲中添加牛磺酸对于加强壳聚糖和细菌之间的反应有协同作用,从而有助于提高分析的灵敏度。文中详细阐述和讨论浓缩方法的具体步骤以及相应浓缩富集机理。相对于没有浓缩步骤,在最佳的实验条件下通过这种方法的检测可获得大约有6000倍浓缩比例,E.coli的检出限是145CFU/mL。并将多步浓缩在线富集方法用于地表水中大肠杆菌的检测,获得了较满意的结果。对比于现有的检测方法,新建立的细菌检测方法在灵敏度,检测速度以及样品量方面都有明显的优势。 第四部分:细菌的万古霉素-Cy5荧光衍生及其在微流控芯片上的在线富集研究 本文利用Cy5标记的万古霉素特异性识别生化样品中微生物细菌,避免了鉴于核酸标记检测方法造成的背景干扰,并在前章多步在线富集的方法基础上,通过在线浓缩富集检测标记后的金黄色葡萄球菌,为生化样品中微生物的检测提供了另外一个思路。文中讨论了衍生条件,Cy5-Van对细菌的响应性能,并对一些机理进行讨论。但是这种标记方法仍然存在一定的缺陷,需要进一步的实验找到更合适生化样品中细菌微生物的标记方法。 第五部分:微流控芯片在线富集技术用于抗生素的分离与检测 本文将胶束电动色谱、场放大进样技术和反转电场堆集技术有效结合起来,在简单“十字”通道微流控芯片上通过在线预富集和胶束电动色谱实现抗生素的高灵敏度分析,并且利用胶束电动色谱确保富集后的样品中多组分分析物能够有效分离。通过“门进样”引入大体积量低传导率的样品分析物进入分离通道,在施加的电压下样品分析物在非均匀电场下富集在缓冲边界。聚苯乙烯磺酸钠作为缓冲添加剂有效地改善了富集后样品中各组分的分离。在最佳条件下,卡那霉素、万古霉素、庆大霉素不仅得到有效分离,而且与传统的“门进样”相比,各组分的富集因子分别为72,135,102,检测灵敏度得到显著提高,各组分检出限分别为8.5×10-7'g/L,4.6×10-7'g/L,1.6×10-6g/L。胶束电动色谱和在线富集技术的联合使用有助于改善分析检测的灵敏度和分离度,这对于小型化分析仪器的商品化运用是非常重要的。
【学位授予单位】:华东师范大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:TN492

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