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《华东师范大学》 2013年
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ATP生物发光法快速测定天然水体细菌总数的研究

崔璐璐  
【摘要】:现行的国家水质量标准中,细菌总数的检测是必不可少的项目。国标法为平板培养计数法,这种方法培养细菌需要48h,在时间上难以满足水质微生物实时检测的要求,且得到的仅为可培养的好氧细菌,不能实现对水体细菌总数的测定。因此找到一种可以替代传统平板计数法的细菌总数快速检测方法非常有必要。ATP生物发光法是基于活体细胞内ATP与荧光素酶及荧光素结合产生光子的机理所设计,它根据ATP含量与细菌数量成正比例关系原理,通过测定样品中的ATP发光值,由发光强度与菌落数量标准曲线推算样品细菌总数,该方法在快速测定水体细菌总数方面具有一定应用价值。 本论文研究了ATP生物发光技术测定天然水体细菌总数的方法。通过对比Tris-HCl、Hepes、甘氨酰甘氨酸三种缓冲液中酶的活性、不同温度下酶的活性变化、酶的本底背景处理时间、BAB浓度及提取时间对酶促反应的影响,构建了生物发光最适反应体系;对实验室保藏菌种大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行发光测定及平板计数,探讨发光强度与菌落数量的相关方程;针对天然水体中存在的体细胞及游离ATP的干扰,采用体细胞提取剂Tritonx-100及apyrase酶组合,研究了各自的最佳使用浓度与作用时间、探讨了该组合对微生物测定的影响,并建立了一套体细胞排除体系;将体细胞排除体系结合生物发光法在天然水体中进行了验证,研究结果可为发生物发光法测定天然水体的细菌总数提供科学依据。结果表明: (1)PH为7.0-8.5的Tris-HCl、Hepes、甘氨酰甘氨酸三种缓冲液,PH为7.8的甘氨酰甘氨酸缓冲液中酶的活性表现最高;荧光素酶低温(4℃)条件下保存48h内活性依然较高,常温(23℃)活性在6h以后下降较快,高温(35℃)下活性急剧下降,到1.5h时活性接近0;新配制的酶液在室温下静置30min时酶的本底几乎降到最低而活性依然较高;细菌破壁剂BAB浓度为0.05%时对酶的活性抑制最小,提取时间为3min时发光值最大。因此确定发光反应的最适反应条件为:pH为7.8的甘氨酰甘氨酸缓冲液,最适反应温度为23℃,酶本底背景处理时间为30min,BAB浓度为0.05%,提取时间为3min。 (2)大肠杆菌和金黄色葡萄球菌发光强度与OD600nm、菌落数量与OD600nm、发光强度与菌落数量之间线性关系良好,相关系数在0.95以上; (3)体细胞排除体系为Tritonx-100与apyrase酶组合,Tritonx-100浓度为0.4%时对酶的活性抑制最小、体细胞提取效率最高,体细胞发光最高值出现在2min时,800mg/L的DEAE-Dx能够逆转荧光素酶的活性,0.2U的apyrase酶能将10-9mol/ml的ATP水解完全,SPSS显著性分析表明0.4%的Tritonx-100和0.2U的apyrase酶组合对微生物含量测定没有显著性影响。 (4)将体细胞排除体系结合ATP生物发光法应用于天然水体测定,与国际标准法得到的结果进行比较,两者的误差为39.27%,但是数量级和趋势是一致的。而未经体细胞排除体系的两者结果相差一个数量级。说明体细胞排除体系能提高ATP发光发测定细菌总数的精确性,具有潜在的应用价值。 通过本研究证实了ATP生物发光法用于水质细菌总数测定的可行性,可为水体细菌总数的快速检测提供科学依据。
【学位授予单位】:华东师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:X832

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