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《华东师范大学》 2015年
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包囊游仆虫休眠包囊形成相关基因和相关蛋白的研究

陈芬芬  
【摘要】:本课题主要研究原生动物的休眠机制,实验以纤毛虫包囊游仆虫作为实验材料,其具有真核细胞的一切生命特征,研究其包囊形成的本质可以为真核细胞分化的调控机制提供理论依据。本研究通过iTRAQ技术、实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)对包囊游仆虫休眠与营养细胞蛋白和基因的表达进行了差异性分析,同时借助FLUTAX(紫杉醇)直接荧光标记技术和相差干涉显微技术对休眠细胞和营养细胞的形态进行了分析比较;并利用RNA干扰技术研究了β-tubulin基因在营养细胞中的功能;最后利用液质联用技术对休眠细胞的壁蛋白组成成分进行了鉴定。利用iTRAQ技术鉴定分析游仆虫休眠细胞与营养细胞之间的差异蛋白,发现了21种与包囊形成相关的蛋白。与营养细胞相比,休眠细胞中有9种蛋白表达下调,12种上调。这些差异性蛋白涉及细胞的各种生命活动,包括细胞骨架的构建、基因的表达、能量的合成与代谢以及应激反应:并且有10种蛋白无115/114的比值,可能为休眠细胞或营养细胞的特异性蛋白,有待进一步研究。随后通过直接荧光标记技术和相差干涉显微技术研究发现,包囊游仆虫从营养细胞转化成休眠包囊的过程中,纤毛大量消失,仅保留一部分纤毛,从而验证了微管蛋白在此过程中确实发生了显著变化。对筛选出的与包囊有关的基因表达量进行了qRT-PCR相对定量分析,与营养细胞相比,休眠细胞中16种基因的表达量发生变化,其中10种基因的表达量明显下调,6种基因的表达量显著上调。这些差异基因在细胞分化过程中发挥着重要的调控作用,使营养细胞能够顺利的形成包囊,从而在不良环境中存活下来。其中一些与能量代谢有关的基因表达显著下调,利用细胞呼吸代谢检测试剂盒检测发现,休眠细胞的呼吸强度远弱于营养细胞,表明休眠细胞的生命活动大大减弱,只进行一些基本的活动以维持生存。对营养细胞的β-tubulin基因进行干扰后,细胞内外都发生了明显的改变。直接荧光标记实验结果表明,实验组的细胞体内会积累大量的颗粒状物质,并且处理时间越长细胞越敏感,在同等实验条件下,细胞膜出现破裂现象,而对照组无此现象。此实验结果表明β-tubulin基因在细胞形态的维持及物质的运输方面发挥重要作用。MTT实验结果发现:在开始的4-6天内实验组与对照组的细胞的生长都呈增长趋势;随后两天实验组的生长出现下降趋势,而对照组都保持稳步生长;而后实验组和对照组细胞的生长又恢复到增长趋势,但实验组包囊游仆虫的生长曲线一直位于对照组的下方,表明β-tubulin基因干扰后会影响细胞的生长繁殖。但对β-tubulin基因的表达量进行检测发现实验组较对照组其表达量未发生显著性差异,表明此干扰对该基因的表达没有明显的影响,但其可能通过其他途径影响细胞的生命活动和形态结构。本研究还利用液质联用技术分离鉴定了包囊壁的组成蛋白,共鉴定出61种可信蛋白,包括各种微管蛋白、运输蛋白、信号转导相关蛋白以及能量代谢相关的酶等。并结合相差显微技术和直接荧光标记技术对包囊壁的表面形态进行了研究,发现其表面有很多由微管蛋白组成凸起结构。本课题从蛋白、基因、能量代谢等角度对包囊游仆虫营养和休眠细胞做了多方面的比较分析,为研究原生动物休眠机制提供了重要的资料,并有助于研究真核生物在逆境下细胞分化的调控机理。
【学位授予单位】:华东师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:Q958.1

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