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《华东师范大学》 2013年
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SWI/SNF染色质重塑复合物的不同组分在人类胚胎干细胞中的功能研究

李兵  
【摘要】:SWI/SNF染色质重塑复合物从进化上来看是一种比较保守的多聚体酶复合物,以BRG1(SMARCA4)或者BRM(SMARCA2)的ATP酶作为核心亚单位,但是两者不能同时存在于同一复合物中。BRG1和BRM依赖ATP水解释放能量来改变核小体的结构从而调节染色质与DNA之间的作用。哺乳动物中至少存在三种复合物形式,BAF-A(BAF250a相关复合物),BAF-B (BAF250b相关复合物),PBAF (BAF180和BAF200相关复合物)。这些SWI/SNF染色质重塑复合物大约由11-15种不同亚基组成,包括其它固有的核心亚单位和可变亚基。其中有八个亚基是这些复合物所共有的,这八个亚基是BRG1(SMARCA4), BAF170(SMARCC2), BAF155(SMARCC1), BAF60A(SMARCD1) BAF57(SMARCE1), BAF53A (ACTL6A), ACTIN和BAF47(SMARCB1). SWI/SNF染色质重塑复合物参与细胞的多种基本生命活动,如转录、复制和染色质修复等。胚胎干细胞可以自我更新并具备向所有细胞系分化的潜力。这两个过程是通过染色质重组重编程基因的表达来实现的。SWI/SNF复合物对胚胎干细胞的多能性影响的报道多以小鼠胚胎干细胞(MES)作为研究模型,在人类胚胎干细胞(HES)中的研究还不是很多。 本论文通过病毒感染的方法构建了稳定干扰SWI/SNF染色质重塑复合物的几个重要亚基的人类胚胎干细胞系,同时通过电转的方法建立了稳定过表达该复合物某些亚基的人类胚胎干细胞系,对SWI/SNF染色质重塑复合物的不同组分在人类胚胎干细胞中的功能及其可能的分子机制做了一定的研究。首先,我确认了在小鼠胚胎干细胞中降低BRG1或者BAF155的表达均会使小鼠的胚胎干细胞失去自我更新和多能性特征,而BAF170敲低表达后对小鼠胚胎干细胞的多能性没有影响。进一步的研究发现敲低BRG1的表达人类胚胎干细胞将失去干细胞的特性,和小鼠胚胎干细胞不同的是敲低BAF155不能改变HES的干细胞特性。取而代之的是BAF170,该亚基缺失导致人类胚胎干细胞失去多能性而发生分化,碱性磷酸酶活性比对照组明显减少,表面特异性抗原Tra-1-60和Tra-1-81的表达和对照组相比也显著降低。BAF155和BAF170在哺乳动物中具有很高的同源性,而且我们进一步的研究发现两者在人类胚胎干细胞的BAF复合物中均有表达,可是它们在HES中的功能却不同。在低表达BAF170的HES中,过表达BAF170可以挽救BAF170敲低所导致的分化现象,但是BAF155却没有此作用,这说明BAF155和BAF170虽然同源却不能互相替代。在HES中BAF170低表达可以使HES失去多能性而BAF155低表达只发现HES克隆比正常的形态偏小,并且发现BAF155低表达后致使HES中E/N-cadherin的表达与正常HES产生了差异。同时,结合之前的研究发现BAF170与BRG1均可以影响HES的干细胞特性从而在HES中扮演着同样的角色,而BAF155则与它们不同。我在人类胚胎干细胞中也建立了BRM、BAF200、BAF250a、BAF250b的稳定干扰细胞系,发现这些组分被敲低后对HES的功能都没有明显影响。SWI/SNF染色质重塑复合物的亚单位在HES中具有不同的功能,可能是因为它们调节的基因不同或者与它们相互作用的蛋白不同而造成的。全基因组表达实验显示BRG1低表达后很多基因上调表达而这些基因在BRM中却变化不大,而下调表达的基因在BRG1低表达后下调的程度比BRM低表达后下调的程度更高。也就是说BRG1与BRM具有共同调节的基因,尽管数目不多。这些结果说明在HES中BRG1与BRM在功能上可能有类似的方面,但BRG1比BRM所起的作用更加显著。进一步的BRG1染色质免疫共沉淀实验结合质谱实验的结果表明,BRG1与多个在HES自我更新、发育及转录调控相关的蛋白相互作用。另外,研究发现BRG1与DNMT1可以相互结合,说明BRG1可能通过影响DNA的甲基化对HES的多能性起调节作用。我们将通过染色质免疫共沉淀实验对BRG1的其它相互作用蛋白做进一步的验证。 SWI/SNF染色质重塑复合物在HES中的功能如此重要,对发育过程也是必不可少的。在小鼠发育过程中,如果将BRG1敲除后小鼠胚胎在着床前就导致早期致死,因此建立了敲除BRG1的诱导型小鼠胚胎干细胞系。初步检测表明该细胞系的基因型、核型鉴定正确,没有支原体污染,BRG1的表达在40H-TM的诱导后能较大程度的被敲除。我用胚球体(EB)形成实验在体外模拟发育过程,发现BRG1被敲除之后EB发育受到了影响,并且胚胎第7.5天的EB打散后诱导形成胚胎生殖细胞(EGCs)的数量也明显降低。接下来我们将继续研究BRG1在发育的各个阶段及其在各个胚层发育中的功能及其作用机制。
【学位授予单位】:华东师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R329.2

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