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《华东师范大学》 2014年
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腹毛目纤毛虫冠突伪尾柱虫休眠相关蛋白及休眠分子机理的研究

高秀霞  
【摘要】:原生动物纤毛虫是一类单细胞真核生物,因为它的高度分化,一些纤毛虫已经成为很好的研究材料。形成包囊和脱包囊的现象不仅存在于寄生性的原生动物中,在许多自由生活的纤毛虫中也普遍存在。当外界环境条件恶劣时,譬如饥饿、温度骤变、密度过大等,会促使纤毛虫形成包囊以此来抵御外界的不良环境。然而,当外界环境条件再次变得适宜时,形成休眠包囊的纤毛虫又会脱包囊而出。可以说,纤毛虫的休眠现象是其在逆境条件下的一种优势生存策略。目前,对纤毛虫休眠现象的研究,已成为探索真核细胞结构和功能调控机制的重要内容之一。对于纤毛虫休眠现象的研究多集中在显微和亚显微水平,关于其形成包囊过程中的形态学和生理学变化已经积累了相当丰富的资料,这些变化表明纤毛虫细胞分化过程涉及到一系列的蛋白和基因的差异表达。但是目前从蛋白质和基因层面来揭示包囊形成机制的研究却较少有人涉猎。从分子水平着手,可以使人们对纤毛虫由营养细胞转变为休眠包囊这一过程所涉及的蛋白水平变化和基因表达机制有更深层次的认识,同时也可为探索真核细胞抵抗逆境的机理和真核细胞与环境相互作用关系提供重要的分子生物学资料。本研究选取腹毛目纤毛虫冠突伪尾柱虫作为实验材料,通过应用蛋白质组学相关技术、实时荧光定量PCR及生物信息学技术,从分子生物学水平上多角度对冠突伪尾柱虫休眠包囊和营养细胞进行比较研究,重点对冠突伪尾柱虫休眠包囊和营养细胞的差异基因和差异蛋白进行定性和定量分析,并分析鉴定了包囊壁蛋白的组成成分。本课题通过在分子水平上比较研究冠突伪尾柱虫休眠包囊和营养细胞,筛选和鉴别出了许多与冠突伪尾柱虫细胞分化形成休眠包囊相关的基因和蛋白,并对这些相关基因和蛋白的功能进行了探讨。本课题的研究结果和结论如下:1.冠突伪尾柱虫休眠包囊和营养细胞全蛋白的LC-MS/MS鉴定分析应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对提取的休眠包囊和营养细胞的全蛋白进行电泳分离,并利用LC-MS/MS (liquid chromatographywith tandem mass spectrometric)技术对电泳分离出的休眠包囊和营养细胞的全蛋白条带进行了定性分析,后续利用生物信息学相关技术进一步对鉴定到的蛋白进行了功能注释。LC-MS/MS鉴定结果表明:冠突伪尾柱虫包囊期细胞共检测出的668种蛋白,营养细胞共检测出的724种蛋白。其中,休眠包囊中鉴定到的668种蛋白中有102种高可信蛋白,营养细胞鉴定得到的724种蛋白中共有88种高可信蛋白。我们主要对休眠包囊的102种和营养细胞的88种高可信蛋白做了进一步的比较分析,发现鉴定出的大部分蛋白为两者所共有,极少数蛋白为休眠包囊和营养细胞所特有。此外,也有部分蛋白为未知功能蛋白。这些差异蛋白的出现表明冠突伪尾柱虫由营养细胞分化为休眠包囊的过程中存在蛋白质表达水平的变化,了解和分析这些共有蛋白和特有蛋白的功能,有助于探究其在冠突伪尾柱虫形成包囊过程中所发挥的作用,对揭示纤毛虫休眠机制具有重要意义。2.冠突伪尾柱虫形成休眠包囊前后差异表达基因的分析基于LC-MS/M S所分析鉴定出的休眠包囊和营养细胞蛋白,从中选取可信度较高的部分共有蛋白,设计其基因引物。利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术,对这些基因在冠突伪尾柱虫休眠包囊和营养细胞中的表达水平进行了比较分析。在所选取的47个基因中,共有27个基因得到有效扩增。其中20个基因表达上调,包括钙通道蛋白基因、钙调蛋白基因和26S蛋白酶体基因等;7个基因表达下调,包括组织蛋白酶基因、rRNA基因及α-微管蛋白等基因。这么多的基因表达变化表明冠突伪尾柱虫包囊形成是一个多基因协同调控表达的过程。对这些基因表达量变化水平的分析,有助于我们了解这些基因在冠突伪尾柱虫休眠过程中所起的作用,同时也利于探究包囊形成过程中可能涉及的基因表达调控。3.冠突伪尾柱虫休眠包囊的包囊壁蛋白组分的鉴定分析分离和鉴定冠突伪尾柱虫多种包囊壁蛋白是本项目的亮点之一。通过应用SDS-PAGE电泳对冠突伪尾柱虫休眠包囊的包囊壁蛋白进行分离,并利用质谱技术对电泳分离得到的8条蛋白条带的组分进行了鉴定分析。鉴定得到的结果主要为应激蛋白和结构蛋白,包括HSP70、β-微管蛋白、β-1,3-N-乙酰氨基半乳糖基转移酶和富含亮氨酸的家族蛋白,还有部分未知功能蛋白,并对鉴定到的蛋白进行了功能分析。本研究结果为阐明冠突伪尾柱虫包囊壁组成提供了重要的分子生物学资料。本研究从蛋白质水平和基因层面探索冠突伪尾柱虫休眠过程中细胞分化的蛋白质事件及其基因调控机制,为揭示纤毛虫由营养细胞分化为休眠包囊过程的内在调控机制和探索真核细胞抵抗逆境的机理积累了重要资料。
【学位授予单位】:华东师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:Q953

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