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《华东师范大学》 2016年
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MFN2对骨骼肌线粒体运动适应的作用研究

贺强  
【摘要】:骨骼肌为主要的运动应答器官,运动中骨骼肌对能量的需求不断地变化,线粒体在应答运动应激引起的氧耗、ATP需求增加的同时,自身形态、结构、功能都发生着积极适应变化,运动促进线粒体生物发生、提高线粒体功能的同时还促进细胞自噬、线粒体自噬等逆向适应,加速细胞新陈代谢和线粒体网络的更新。线粒体是高度动态化细胞器,不断地进行着融合、分裂,线粒体融合、分裂不但在调控线粒体形态、功能以及对凋亡信号的应答中扮演着重要的角色,还与线粒体生物发生和线粒体自噬过程紧密偶联。MFN2不但调控线粒体外膜的融合,还调控线粒体与内质网的相互作用,影响线粒体对Ca~(2+)的摄取和细胞能量代谢。MFN2还在E3泛素连接酶Parkin介导的线粒体自噬中起重要作用,MFN2缺失抑制了Parkin向功能紊乱线粒体的定位;同时,MFN2缺失还提高了PGC-1α的表达,提高线粒体生物发生。MFN2在运动调控骨骼肌线粒体生理适应中的作用尚不清楚,本研究着重从线粒体生物发生、线粒体自噬和线粒体融合、分裂三个角度探索阻断MFN2对运动训练调控骨骼肌线粒体运动适应的影响和相关分子机制。目的:本文选取MCK-Cre MFN2~(flox/flox)小鼠为研究对象,探索MFN2在骨骼肌线粒体自噬和线粒体生物发生中的作用,探索阻断MFN2对运动调控骨骼肌线粒体生理适应的影响,主要通过线粒体生物发生、线粒体自噬和线粒体融合、分裂三个角度探讨运动调控骨骼肌线粒体生理适应的机制。方法:通过Cre/Loxp技术构建条件性骨骼肌MFN2基因敲除小鼠及同窝对照小鼠,基因型分别为MCK-Cre MFN2~(flox/flox)和MFN2~(flox/flox)。1)动物水平对MFN2基因与骨骼肌线粒体自噬和线粒体生物发生的关系进行探索。实验分组:3月龄雄性MCK-Cre MFN2~(flox/flox)小鼠和同窝MFN2~(flox/flox)小鼠分别作为基因敲除组(KKnockout group, K, n=24)和正常对照组(Control group, C, n=24)。每组随机选取8只小鼠分离双侧股四头肌、腓肠肌和胫骨前肌,左侧用于RT-qPCR实验,右侧用于Western blotting实验;每组再随机选取8只小鼠,分离双侧腓肠肌和股四头肌,左侧4%多聚甲醛固定,制作石蜡切片用于HE染色和免疫组织化学指标检测,右侧2.5%戊二醛电镜固定液固定,用于电镜检测线粒体形态、自噬小体等;每组再随机选取8只小鼠,分离双侧腓肠肌用于提取线粒体,检测线粒体膜电位、柠檬酸酶(CS)活性、H_2O_2释放,部分样品用于骨骼肌氧化应激指标检测。2)动物水平对MFN2与骨骼肌线粒体运动适应的关系进行探索。实验分组:2月龄MCK-Cre MFN2~(flox/flox)小鼠和同窝MFN2~(flox/flox)小鼠随机分为正常对照组(Control group,C, n=8)、正常运动组(Exercise group, E, n=8)、基因敲除组(Knockout group,K, n=8)、基因敲除运动组(Knockout Exercise group, KE, n=8)。 E和KE组小鼠进行4周耐力跑台训练,跑速为14m/min, C和K组置于静止跑台,自由活动,最后一次运动训练结束12h处死小鼠分离双侧腓肠肌,左侧用于RT-qPCR实验,右侧用于Western blotting口氧化应激指标检测。本研究检测指标具体如下:1)代谢相关指标:体重、附睾脂肪含量及体质百分比、肝脏和心脏湿重。2)线粒体融合、分裂相关指标:RT-qPCR检测MFN2、MFN1、Drp1、FIS1、OPA1、 MFF mRNA表达;Western blotting检测MFN2、MFN1、OPA1、Drp1、MFF蛋白表达。3)细胞自噬和线粒体自噬相关指标:RT-qPCR检测Atg5、Atg12、ULK1、Parkin、PINK1. LC3、p62、BNIP3、FUNDC1、LAMP2 mRNA表达;Western blotting检测ULK1、Parkin、 PINK1、LC3、BNIP3、p62、Atg5、AMPKa蛋白表达以及AMPKa Thr~(172)和ULK1Ser~(555)磷酸化水平。4)线粒体生物发生相关指标:RT-qPCR检测PGC-1α、TFAM、NRF1、TFBIM、ATP5a. COXI、COX5b. NDUFS8 mRNA表达,mtDNA含量;Western blotting检测PGC-1α、 TFAM、NRF1、TOM20蛋白表达。5)线粒体功能指标:检测线粒体膜电位、CS活性,免疫组化COX和SDH染色。6)形态学指标:HE染色观察肌纤维形态和横截面积,电镜检测肌纤维形态、线粒体形态以及自噬小体等。7)氧化应激指标:检测离体线粒体H_2O_2释放和在体骨骼肌H_2O_2和MDA含量,T-SOD活性。结果:1)通过Cre/Loxp技术建立了骨骼肌特异性MFN2基因敲除小鼠模型,骨骼肌MFN2 mRNA和蛋白含量较比对照组均显著下降(p0.01)。2)与C组相比,K组小鼠骨骼肌中异常线粒体增加,部分线粒体出现肿胀,有的嵴折叠下降,甚至出现不规则的空泡;小鼠骨骼肌Drp1蛋白含量显著提高(p0.05)。与C组相比,K组小鼠骨骼肌线粒体膜电位显著下降(p0.05),线粒体H_2O_2释放率显著高于C组(p0.05),骨骼肌H_2O_2和MDA含量均显著高于C组(p0.05)。与C组相比,K组小鼠骨骼肌中PGC-1α、TFAM和线粒体标志物TOM20蛋白含量显著提高(p0.05)。3)与C组相比,K组小鼠骨骼肌FUNDC1、BNIP3 mRNA表达显著提高(p0.05),BNIP3、 Parkin、p62蛋白含量显著增加(p0.05), LC3-Ⅱ/Ⅰ比值显著提高(p0.05), AMPKαThr~(172)和ULK1Ser~(555)位点磷酸化水平显著下降(p0.05),肌纤维中自噬小体堆积。4)与C组相比,E组小鼠骨骼肌MFN1、MFN2、Drp1、FIS1mRNA表达显著提高(p0.05),MFN1、Drp1蛋白含量显著提高(p0.05);与K组相比,KE组小鼠MFN1、MFN2、Drp1 FIS1mRNA表达显著提高(p0.05), MFN1、Drp1蛋白含量显著提高(p0.05);KE组小鼠骨骼肌Drp1蛋白含量显著高于E组(p0.05)。5)与C组相比,E组小鼠骨骼肌PGC-1α、NRF1、TFAM、TFB1M、COXI、COX5b mRNA表达显著提高(P0.05或P0.01),ntDNA含量、PGC-1α、TFAM 和 TOM20蛋白含量显著提高(P0.05);与K组相比,KE组小鼠骨骼肌PGC-1α、NRF1、TFAM、TFB1M、 COXI、COX5bmRNA表达显著提高(P0.05或P0.01), PGC-1α、TFAM和TOM20蛋白含量显著提高(P0.05);KE组小鼠骨骼肌TFAM蛋白含量显著高于E组(P0.05)。6)与C组相比,E组小鼠骨骼肌LC3、Atg5、ULK1、BNIP3、Parkin、FUNDC1 mRNA表达显著提高(P0.05或P0.01),LC3-II/I匕值显著提高(P0.05), Parkin、PINK1、BNIP3.ULKl蛋白含量显著提高(P0.05), AMPKαThr~(172)、ULK1 Ser~(555)位点的磷酸化显著提高(P0.05);与E组相比,KE组小鼠骨骼肌LC3、Atg5、ULK1、BNIP3、FUNDC1 mRNA表达显著提高(P0.05),LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、p62、PINK1、ULK1蛋白含量没有显著变化,Parkin、BNIP3、AMPKαThr~(172)、ULK1 Ser~(555)位点的磷酸化显著提高(P0.05);KE组小鼠骨骼肌BNIP3、FUNDC1 mRNA表达以及Parkin、BNIP3、p62蛋白含量显著高于E组(p0.05)。7)与C组相比,E组小鼠T-SOD活性显著提高(p0.05),MDA显著降低(p0.05);与K组相比,KE组小鼠T-SOD活性显著提高(p0.05);KE组小鼠骨骼肌H2O2、MDA显著高于E组(p0.05或p0.01)。结论:1)MFN2缺失扰乱了骨骼肌线粒体融合、分裂动态平衡,引起异常形态线粒体增加,提高线粒体活性氧的产生和骨骼肌氧化应激。2)MFN2缺失提高了骨骼肌线粒体生物发生,有利于维持mtDNA含量和线粒体呼吸链功能。3)MFN2缺失抑制了骨骼肌细胞自噬和Parkin介导线粒体自噬,但代偿性提高了BNIP3依赖的线粒体自噬途径。4)耐力训练建立更高水平的骨骼肌线粒体融合、分裂,伴随着线粒体生物发生、细胞自噬和线粒体自噬的提高,提示运动训练对调控骨骼肌线粒体质量控制有积极作用,MFN2的缺失虽然抑制了运动训练诱导的骨骼肌细胞自噬和Parkin介导的线粒体自噬,但进一步提高了线粒体生物发生和BNIP3介导的线粒体自噬。5)耐力训练并不能通过激活AMPK-ULK1信号通路改善MFN2缺失小鼠骨骼肌细胞自噬水平。
【学位授予单位】:华东师范大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:G804.2

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