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人源糖原合成酶激酶-3β(Human Glycogen Synthase Kinase-3β)的性质研究及其抑制剂的高通量筛选模型建立

毛伟峰  
【摘要】:糖原合成酶激酶-3(GSK-3)是一个多功能的丝氨酸/苏氨酸类激酶,在真核生物中普遍存在。在哺乳动物中包括两个亚型,即GSK-3α和GSK-3β。GSK-3至少在三条细胞通路上有作用:Wnt/wingless,PI-3'Kinase以及Hedgehog信号通路,该酶的作用主要包括调节糖原的合成代谢,参与细胞的分化与增殖等。研究发现,GSK-3在某些疾病,例如阿尔茨海默尔氏病症以及非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)中,其活性会异常升高。现已发现了几种针对该酶的抑制剂,例如aloisine,paullones和马来酰胺类化合物等。这些抑制剂的确在分子水平特异性地抑制GSK-3的活性,而对其他激酶几乎没有作用;关于这些抑制剂的研究工作也已经在细胞水平和动物模型上开展起来,为开发以GSK-3为靶点的新的治疗药物创造了良好的基础。 本论文的目的是克隆表达纯化重组人源GSK-3β(HsGSK-3β)并研究其酶学性质;在此基础上,建立HsGSK-3β抑制剂的高通量分子筛选模型。并通过对国家新药筛选中心化合物库的筛选,寻找高亲和力的HsGSK-3β抑制剂,期望能进一步成为治疗二型糖尿病以及神经退行性疾病的先导化合物。 本论文的研究内容主要包括通过PCR方法获得HsGSK-3β的编码序列,克隆至原核表达载体pGEX-KG上;将重组质粒pGEX-KG/HsGSK-3β转化大肠杆菌BL21(DE3)/codon plus后,经IPTG诱导表达,蛋白以可溶形式存在。GST融合重组蛋白经过谷胱甘肽亲和层析纯化,凝血酶切割,SP阳离子交换层析去处GST蛋白,超滤离心,Q-Sepharose阴离子交换层析纯化,得到较纯净的HsGSK-3β。 随后,我们确定了包括同位素的用量,酶反应的线性范围以及反应时间。对HsGSK-3β进行了一系列的酶学性质的考查,对测活条件进行了优化。考察了包括Mg~(2+)、DTT、金属螯合剂、离子强度等因素对酶活性的影响,确定了测活反应的体系为30ul反应体系,在酶反应体系中含有50mM Tris-HCl pH7.5,10mM MgCl_2,2mM DTT,50uM ATP,0.2uCiγ-~(33)PATP,50uM CREB,100nMHsGSK-3β,反应时间为15分钟。随后,进行了pH依赖性、酶动力学分析、酶抑制作用分析以及酶的稳定性分析。pH依赖性实验表明HsGSK-3β属于中性蛋白激酶。分析了HsGSK-3β特异性多肽底物CREB以及激酶共同底物ATP的酶动力学性质,以及阳性抑制剂Aloisine A对HsGSK-3β的抑制作用,结果表明重组HsGSK-3β具有天然HsGSK-3β的激酶活性。酶稳定性分析说明酶能够长期保存在-80℃,贮存溶液为50mM Hepes pH7.2,100mM NaCl,1mM DTT,1mM 华东师范大学硕士毕业论文 EDI人的条件下。 考察了DMso以及测活体系改变(体积改变而导致ATP:Y一,3P ATP掺入比 的改变)对活性的影响,确定进行分子水平高通量抑制剂筛选的50ul酶反应体 系为50 mM Tris一HCI pH 7.5,10 mM MgC12,2 mMD盯,25 uMATp,0.15uCi 竹3,P灯P,50 uMe咫B,100咖价osK一邓,4%DMSO和40 ug加l样品。建立 了HsGsK一3p抑制剂高通量筛选的标准化操作流程。对国家新药筛选中心化合物 库中的2720个纯化合物样品进行筛选,筛选在2天内完成,其中有145个样品 的抑制率在50%以上。挑选这些样品进行了两孔原浓度复筛以及稀释5倍后的两 孔筛选,对稀释5倍的两孔的抑制率都在50%以上的化合物进行多浓度的抑制测 定,计算ICS。值。 筛选得到ICS。大于10 uM而小于20 tlM的化合物共有6个,IC50小于10 uM 的化合物有3个。其中抑制效果最好的化合物编号为SH00011738,分子量330.36, IC50为2.24u加1,是结构新颖的化合物。筛选到这些化合物,为进一步进行细胞 水平检测其抑制凋亡,降低血糖等作用以及化合物结构改造打下了良好的基础。


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