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《华东师范大学》 2009年
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前脑特异性过表达VGLUT1转基因小鼠的构建及初步表型分析

竺淑佳  
【摘要】: 谷氨酸是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质。近些年,研究人员应用分子生物学技术成功地从哺乳类动物克隆出三种脑内特殊的Na~+依赖的囊泡膜谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporters,VGLUTs),分别命名为VGLUT1、VGLUT2和VGLUT3。研究证实,VGLUTs可作为中枢神经系统内谷氨酸能终术的特异性标记物,谷氨酸的量子释放要依赖于囊泡膜上VGLUTs的数量。那么,遗传性增强VGLUTs的数量会对神经递质释放量、神经递质释放的调控机制、突触可塑性及学习与记忆等大脑基本功能产生影响吗? 本研究分别从C57BL/6小鼠和Sprague Dawley大鼠的cDNA文库中克隆出VGLUT1的cDNA,将VGLUT1片段载入p265载体中,再利用特定的限制性内切酶,将p265-VGLUT1片段连接到p279载体上,利用p279载体上前脑特异性表达的钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱα亚基(简称α-CaMKⅡ)为启动子,成功构建p279-VGLUT1重组质粒。通过对B6/CBAF1小鼠受精卵进行原核显微注射,获得前脑特异性过表达VGLUT1转基因小鼠。实验注射移植后出生原代小鼠共89只,经PCR和Southern blotting检测得到VGLUT1阳性Founder小鼠2只;用透射电镜观察到转基因小鼠的海马中突触前膜内囊泡丰富,大量集聚并成堆分布;毛细管电泳技术检测了转基因小鼠的皮层、海马、丘脑、小脑内各单胺类神经递质的含量,结果表明5-羟色胺、多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素四种单胺类神经递质在各脑区的分布均没有显著性的变化。 为研究前脑特异性过表达VGLUT1基因对学习与记忆及情绪相关行为有何影响,我们将转基因小鼠和同窝对照小鼠分成3月、6月、12月和16月龄各个年龄梯度,利用开场运动、高架十字迷宫、新异物体探测、恐惧记忆等行为学实验,来探讨囊泡膜谷氨酸转运体对学习与记忆的影响及其作用机制。实验结果显示,开场运动中,VGLUT1过量表达对于老年小鼠的运动量有显著性的增加,但不影响青年小鼠的基本运动量;高架十字迷宫和新异物体探测实验提示,VGLUT1过量表达不改变转基因小鼠的焦虑抑郁相关的情绪状态和短时程与长时程识别能力记忆;恐惧记忆实验测试了3月龄和6月龄的转基因和对照组小鼠的长时程场景恐惧记忆与声音提示的恐惧记忆,结果提示,6月龄的转基因小鼠在场景恐惧记忆的实验中的僵直反应持续时间明显低于对照组,且有显著性差异,而在声音提示相关的恐惧记忆的测试中,两组小鼠之间无统计学差异。实验提示了前脑特异性过表达VGLUT1基因可能会阻碍长时程海马依赖的恐惧记忆的形成。
【学位授予单位】:华东师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:Q42

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