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《华东师范大学》 2009年
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污水处理厂活性污泥中四环素耐药基因和耐四环素乳糖发酵型肠杆菌研究

郭怡雯  
【摘要】: 抗生素在人类以及畜禽业中的滥用导致了环境中耐药细菌大范围的传播。因此,为了避免对公共健康产生影响,本研究利用现代分子生物学技术结合细菌传统分离培养等方法,分析污水厂水样中耐四环素乳糖发酵型肠杆菌(TR-LFE)的多样性,并针对污水厂活性污泥以及自然湖体中的四环素耐药基因做基因检测及量化,以了解本地区污水厂中耐药菌所占的比例、活性污泥中四环素耐药基因的分布情况以及一般地表径流中所含有耐药基因的种类和数量。 研究结果显示,从污水厂所提取的水样进行选择性培养后看到,在含抗生素平板上,乳糖发酵型肠杆菌(LFE)中绝大多数是耐四环素乳糖发酵型肠杆菌(TR-LFE),占居平板的70%~90%。但是经一系列检测后表明,污水厂的污水处理过程并不能大幅度的减少致病菌的数量。与此同时,剩余污泥最终却是经过重力浓缩池浓缩后直接装船外运,并没有具体的处理方法。可见,绝大多数的致病菌将直接排入环境。 污水厂进水,活性污泥,出水水样中耐四环素乳糖发酵型肠杆菌(TR-LFE)tet基因的出现频率在0%~69.23%之间。总共检测到:tet(A),tet(B),tet(C),tet(D),tet(E),tet(M),tet(G),tet(X)这八种耐药基因,没有检测到核糖体保护蛋白编码的tet(O)和tet(S)基因;乳糖发酵型肠杆菌(LFE)tet基因的出现频率在3.7%~68.18%之间,没有检测到核糖体保护蛋白编码的tet(M),tet(O)和tet(S)基因。 通过对328株耐四环素乳糖发酵型肠杆菌(TR-LFE)和乳糖发酵型肠杆菌(LE)的PCR-RFLP分类,测序得到5种不同菌株,分别为大肠杆菌、志贺氏菌、克雷伯氏菌、气单胞菌和鲍氏不动杆菌,其16S rDNA的同源性分别为100%~99%;并用相应的tet引物对其中的某些菌株进行再次测序,同源性也都在100%~97%之间,可见此前的实验研究是科学严谨并是可信的。 对污水厂活性污泥中耐四环素基因在不同季节和工况下的检测发现,在不同的时间点,tet基因广泛分布在活性污泥中,但是污水厂一系列的处理过程也不能有效减少tet基因的种类。同时,经过对滴水湖生物膜上带有的耐药基因检测对比后证明了污水厂带有的耐药基因远远高于自然界一般地表径流中的含量。 通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)对目标基因进行量化,看到闵行污水厂中tet(A)基因浓度要高于tet(C)基因浓度,并且这两种基因浓度要大大高于自然湖体中携带的含量。从中可以看出,也许由于上海甚至是整个中国地区对抗生素药物的使用及排放没有做过多的控制,使得本地区污水中的耐药基因浓度要远远高于其他地区。 最后,对带有tet基因的菌株进行质粒提取后发现,大多数菌株都含有大小及数量不等的质粒条带,质粒的获得率大于93.4%。同时将带有tet(A),tet(B),tet(C)和tet(D)耐药基因的质粒进行测序发现,其结果与致病性肠杆菌具有高度同源性。但仅根据本次实验的研究深度,未能观察到携带质粒的菌株与其耐药性及耐药基因之间有明显关系这需要在后续的研究中进一步的深入。
【学位授予单位】:华东师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:X172

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