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《华东师范大学》 2009年
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新型电化学联用技术的建立及其在脑神经科学中的应用研究

朱伟  
【摘要】: 随着生命科学的发展,复杂样品体系的分离、分析已经成为当前分析化学的重要研究方向之一。为了获得全面、准确的信息,复杂样品的分析过程包括了从常量到微量、痕量分析;从成分到结构、形态分析,从静态到动态分析,从破坏到非破坏分析。这就要求分析化学能够实现灵敏、选择、无损探测,以及痕量生物活性物质的实时、在体和在线分析。显而易见,单一的分析技术已经不能满足现代测试的需求,而分析方法的联用技术则是今后分析化学发展的一大趋势,也必将成为揭示生命过程奥秘的有力工具。 本论文将电化学分析方法与高效液相色谱相结合,实现复杂样品中多组分的同时测定;微渗析取样技术的引入,实现了生物样品的在线分离和检测,可以了解体中活性物质的动态变化,且能真实反映取样位点目标物质的浓度。目前,液相色谱电化学-微渗析取样技术已成为生命科学领域中最常用的分析手段之一,尤其在脑神经科学研究中扮演着重要的角色。同时,我们将电化学与光化学相结合,建立半导体纳米材料光电化学体系,并应用于酶活的检测及其抑制动力学的研究。该方法为探讨脑神经损伤性疾病中酶的生物学功能的异常变化提供了一种新的分析手段。本论文的具体工作包括以下几个方面: 1.四氢生物蝶呤对大鼠纹状体中单胺类神经递质影响的液相色谱-电化学检测研究 研制了新型Pt-Pd纳米修饰电极,并将其作为液相色谱电化学检测器,同时与微渗析活体取样技术相结合,探讨了外源性的四氢生物蝶呤对大鼠脑纹状体中单胺类神经递质的影响。研究表明外源性的四氢生物蝶呤能提高大鼠纹状体中单胺类神经递质多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)及其代谢产物5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)和高香草酸(HVA)的含量。同时还进行了四氢生物蝶呤动力学分析,探讨了四氢生物蝶呤和单胺类神经递质浓度与时间的变化,为神经退化性疾病的病理学、药理学研究提供了新的分析手段和可靠的实验数据。 2.内源性神经毒素(R)-salsolinol和N-methyl-(R)-salsolinol对大鼠脑内单胺类神经递质影响的色谱电化学研究 利用循环伏安法制备了新型乙酰胆碱(ACh)化学修饰电极(CME),该电极对内源性神经毒素(R)-salsolinol和N-methyl-(R)-salsolinol,以及单胺类神经递质多巴胺(DA)、3,4-二羟苯乙酸(DOPAC)、5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)具有良好的电催化作用,并且灵敏度高,选择性好。将ACh修饰电极作为高效液相色谱(HPLC)电化学检测器,并与微渗析取样技术联用,研究了内源性神经毒素(R)-salsolinol和N-methyl-(R)-salsolinol对大鼠脑纹状体中多巴胺能神经系统的损伤作用。实验结果表明内源性神经毒素对多巴胺能神经系统中的代谢酶产生抑制作用,从而引起单胺类神经递质含量的异常变化,这一发现为帕金森氏病的致病机理研究打下了基础。 3.内源性神经毒素对多巴胺能和胆碱能神经元损伤的液相色谱-电化学研究帕金森氏病是一种慢性神经系统退行性疾病,其确切的致病机理尚未清楚,但近年来,神经毒素学说得到了越来越多的关注。同时还发现帕金森氏病并不仅仅表现为多巴胺能神经元的损伤,而且与胆碱能系统也密切相关。本文利用液相色谱电化学检测与微渗析取样的联用技术,持续、动态检测了神经系统损伤过程中内源性神经毒素的代谢过程和多巴胺与乙酰胆碱的平衡变化,研究了内源性神经毒素(R)-salsolinol和N-methyl-(R)-salsolinol对大鼠脑纹状体中多巴胺与乙酰胆碱平衡的影响。实验结果表明,(R)-salsolinol和N-methyl-(R)-salsolinol不仅能通过抑制多巴胺的合成及其代谢过程中的相关酶活性来损伤多巴胺能系统,而且可以通过抑制乙酰胆碱酯酶活性来损伤胆碱能系统,从而破坏多巴胺与乙酰胆碱之间的平衡,引发帕金森氏症。 4.新型微渗析取样-电化学检测装置用于内源性神经毒素对胆碱能系统的损伤研究 乙酰胆碱(ACh)及其水解产物胆碱(Ch)是两种重要的胆碱能神经递质,在神经信号传导过程中起着关键性的作用。脑组织中乙酰胆碱和胆碱含量的异常变化与神经系统性疾病密切相关,因此,同时检测这两种神经递质对神经损伤性疾病的病理学研究具有十分重要意义。本论文研制了一种新型的微渗析取样-电化学检测装置,采用铂微电极电聚间苯二胺和酪胺固定乙酰胆碱酯酶(AChE)和胆碱氧化酶(ChO)制成ACh/Ch和Ch传感器,并与微渗析取样技术联用,实现ACh和Ch的活体检测。实验表明,通过聚合间苯二胺和酪胺可以提高生物传感器的稳定性和抗干扰能力,在与微渗析取样技术联用后,ACh/Ch传感器可应用于神经递质的活体检测。同时,利用该微渗析取样-电化学检测装置研究了内源性神经毒素N-methyl-(R)-salsolinol对乙酰胆碱和胆碱含量的影响,为帕金森氏病神经毒素致病机理研究提供了可靠的实验数据。 5.内源性神经毒素N-methyl-(R)-salsolinol对乙酰胆碱酯酶活性损伤的光电分析化学研究 乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是一种丝氨酸水解酶,是生物神经传导中的一种关键酶,它在神经信号传导过程中起着重要的作用。乙酰胆碱酯酶活性的异常变化与中枢神经系统损伤性疾病密切相关。本文利用半导体复合纳米材料建立光电分析体系,应用于乙酰胆碱酯酶活性检测的研究。我们采用光电协同法催化制备了Au纳米颗粒掺杂的高序排列的二氧化钛纳米管阵列(TiO_2NTs),然后通过交联法来固定AChE,制备成Au-TiO_2-AChE复合体系,并应用于内源性神经毒素N-methyl-(R)-salsolinol[(R)-NMSal]对AChE活性抑制作用的研究,所建立的光电分析方法具有很高的灵敏度。研究结果表明:神经毒素(R)-NMSal对AChE产生可逆性混合型的抑制作用,这与由(R)-NMSal引起的帕金森氏病的致病机理密切相关,也为AChE在神经退行性疾病的致病机理研究提供了非常有意义的结果。
【学位授予单位】:华东师范大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R741

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