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小鼠核因子κB受体活化因子配基(mRANKL)活性区的克隆、表达及生物活性分析

翟春燕  
【摘要】: 核因子κB受体活化因子配基(RANKL)是诱导破骨细胞分化,成熟的重要因子,在生物学及医学研究中具有广泛的应用。RANKL主要结合到破骨前体细胞的核因子κB活化因子受体(RANK)上,启动下游NF-κB,P38,ERK,JNK等信号通路,刺激破骨细胞的分化,成熟及成熟后的破骨细胞存活。由于RANKL在破骨细胞的发育过程中发挥重要作用,所以它的失调可引发多种骨骼疾病,如骨质疏松,风湿性关节炎等疾病。现在开发了多种针对RANKL及它所调控的信号通路的药物,用于治疗RANKL所引发的骨骼疾病。因此建立制取高纯度的鼠源RANKL(mRANKL)重组蛋白,并诱导破骨细胞前体向破骨细胞分化这个模型具有重要的现实意义。它不仅可以为治疗骨骼疾病的筛药实验提供模型,而且可以极大的降低实验室成本。 在本实验中,以鼠的骨髓细胞cDNA为模板,利用PCR技术体外扩增小鼠核因子κB受体活化因子配基(mRANKL)活性区cDNA,将PCR产物克隆至His标签的融合蛋白表达载体pET28a(+),鉴定正确的质粒转化至BL21表达菌中。通过不同温度、IPTG浓度及诱导时间诱导目的蛋白表达,筛选出mRANKL融合蛋白表达的最佳条件。以最佳条件大量纯化mRANKL重组蛋白,纯化后的蛋白过滤并稀释成不同浓度,与商业购买的mRANKL蛋白同时分别刺激小鼠单核/巨噬细胞Raw264.7细胞分化,可以看见有明显的破骨细胞形成,表明mRANKL重组蛋白具有生物活性,可替代商业产的鼠源RANKL。


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