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荧光假单胞菌的分离及蝎毒基因的原核表达

陆文蔚  
【摘要】:荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)是植物内生菌和植物根际微生物,它有促进植物根际生长、生物防治双重功能。北非蝎昆虫毒素AaHIT1(Androctonus australis Hector insect toxin,AaHIT)是神经毒素,能专一作用于昆虫而对哺乳动物无害或毒性很小,在开发新型生物杀虫剂的领域里有着诱人的前景。从上海周边的宝山、奉贤、浦东等地区采集植物根际土壤,用KB培养基分离出产荧光的菌株,经过形态观察和生化鉴定,筛选出其中的荧光假单胞菌,利用这些荧光假单胞菌与农作物病原微生物通过菌斑抑制法,从中分离到有抑制病原菌作用的菌株。大量实验和文献证明,荧光假单胞菌是良好的基因工程菌的受体菌,所以,本实验将蝎昆虫毒素AaHIT1 基因转入分离得到的荧光假单胞菌中,使AaHIT1 基因能在原核系统中表达。首先,根据AaHIT1的氨基酸序列以及原核微生物对密码子的偏好,设计DNA 的编码序列。由于设计出的AaHIT1 基因将要在大肠杆菌中试表达,所以,设计DNA 序列时,要考虑大肠杆菌对密码子的偏好。其次,依据AaHIT1 的DNA 序列设计互补的8条引物,在退火、延伸的温度下,8 条引物相互拼接,经测序鉴定形成了与预先设计的AaHIT1 基因序列一致的DNA 序列。将AaHIT1 的编码序列与pET32a载体连接,构建pET32a/ AaHIT1 重组质粒,在E. coli Bl21 中进行试表达。表达成功后,将AaHIT1 的编码序列克隆到多宿主表达载体pSUP106 中,形成pSUP106/ AaHIT1 重组载体,将其导入到有抑菌作用的荧光假单胞菌中,表达产物经SDS-聚丙烯酰胺电泳检测,结果证明北非蝎昆虫毒素AaHIT1 已在荧光假单胞菌中表达。进一步表明,为研制“双价”环境友好型基因工程荧光假单胞菌奠定了基础。


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