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云芝糖肽(PSP)中热原物质检查和去除方法的研究

冯梅  
【摘要】: 本课题对云芝糖肽(Polysaccharopeptide of Coriolus versicolor,PSP)的热原检查方法、热原去除方法及其冷冻干燥方法进行了研究。 首先,比较了普通鲎试剂凝胶法,抗增液联用鲎试剂凝胶法和特异性鲎试剂凝胶法等定性方法对PSP中内毒素的测定结果,发现在测定允许范围内结果均为阳性,表明PSP中存在干扰物质不适用这些方法。定量测定采用同体系模型法进行,即以PSP溶液代替无热原水作为鲎试剂的反应介质制作标准曲线以扣除PSP中的干扰因素。结果发现PSP中内毒素含量为2949.9EU/g,高于作为注射剂的内毒素估计限值(2400EU/g),需要进行去热原处理。该法在PSP稀释300倍时的回收率为104±10.9%,标准曲线的相关系数(R)为0.997,完全符合国家药典内毒素定量检测标准,可用于PSP的检测。 其次,对PSP中热原的去除工艺进行了研究,比较了活性炭吸附法、超滤法和多粘菌素亲和层析法对PSP中热原去除的效果,测定了这些工艺对PSP的多糖、蛋白质含量及分子量理化性质的影响和对体外刺激脾细胞增殖和抑制Molt-4细胞生长的活性。结果表明1%活性碳在pH为7.5,温度为90℃时处理100mg/ml的PSP水溶液1小时可使PSP中的内毒素含量降低到1773.9EU/g,但该法虽对分子量分布和体外免疫活性无明显影响,却显著损耗PSP成分,特别是其中的蛋白成分,并降低体外抑瘤活性。超滤法将PSP分离成分子量段为30万以上、介于30万和5000之间和5000以下的三个组分,结果发现5000以下分子量段的PSP内毒素降低到322.6EU/g,但该法改变了PSP的总体性质,各组分的理化性质和生理活性与原PSP有很大差异,因此也不适用。多粘菌素亲和层析可显著去除PSP中的热原,当药/料比为5:1时循环层析3次可使PSP中内毒素降至2301EU/g,满足制备注射剂的要求。该法不显著改变PSP的多糖、蛋白含量和分子量分布,对免疫、抑瘤活性无显著影响,为最适合于PSP的热原去除方法。 此外,本课题还对PSP的冷冻干燥工艺进行了初步研究。发现在装量为1ml,PSP浓度为50mg/ml的条件下,用-70℃乙醇预冻在-20℃冷冻过夜,真空度100-150mtor,冻干24小时后,所得的冻干品外观品质最好,并且无理化特征和药理活性的改变。


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