MGF对肌卫星细胞增殖及Akt蛋白表达的影响

【摘要】： 研究目的： 骨骼肌卫星细胞是骨骼肌中具有分化增殖潜能的肌源性干细胞,在骨骼肌的生长、创伤修复和运动性骨骼肌的适应性肥大方面发挥重要的作用。IGF-1已被证实在骨骼肌的肥大过程中发挥重要的调节作用,可以促进离体培养的骨骼肌卫星细胞的增殖和分化。MGF (Mechano growth factor)是近年来发现的IGF-1的异构体,是惟一在运动训练和肌肉损伤后显著上调的因子,且具有促进肌卫星细胞增殖的功能。外源性MGF干预是否能够促进骨骼肌卫星细胞增殖,目前尚不明确。鉴于此目的,本研究且通过离体培养骨骼肌卫星细胞,通过不同剂量的MGF干预,探讨对卫星细胞增殖的影响及相关的信号通路中蛋白的表达,为进一步摸索MGF促进肌肉生长的机制,同时也为MGF在临床和运动实践中的应用提供实验依据。 研究方法 4周龄雄性SD鼠一只,约100g,无菌条件下分离大鼠腿部、背部肌肉,Ⅱ型胶原酶和胰酶两步酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法纯化细胞,用结蛋白(desmin)免疫组织化学进行细胞的鉴定。调整细胞密度,将细胞按MGF浓度分为Ong/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和150ng/ml五组,用CCK-8检测肌卫星细胞的增殖情况；BCA法测定各组卫星细胞中总蛋白的表达情况；Western Blot检测骨骼肌卫星细胞Akt及p-Akt蛋白的表达情况。 研究结果 1、肌卫星细胞原代培养：刚分离出来的卫星细胞圆形,折光性强。48小时后贴壁完全,细胞形状不规则,可见大小突起；4天后,细胞之间可见突起连接,细胞呈扁梭形,细胞密度增加。6天后细胞之间相互产生连接,部分细胞分化为肌管。 2、肌卫星细胞增殖情况：与对照组相比,25ng/ml组和50ng/ml组在一定时间范围内促进骨骼肌卫星细胞的增殖(P0.05)。25ng/ml组在24小时到96小时内显著促进细胞增殖(P0.01)。50ng/ml在24小时到72小时内显著促进细胞增殖(P0.01)。而100ng/ml和150ng/ml组与对照组相比没有显著差异。 从不同时间段来看,与0小时相比,第24小时阶段仅25ng/ml组有高度显著性差异(P0.01)；第48小时和72小时阶段,25ng/ml和50ng/ml组具有高度显著性差异差异(P0.01)；特别是在72小时,两组的OD值均达到最高。在96小时时,25ng/ml组与0小时时相比显著性具有差异(P0.05),其他组无差异。 肌卫星细胞总蛋白表达情况：骨骼肌卫星细胞BCA测定结果显示,25ng/ml组总蛋白含量显著高于对照组(P0.01)；50ng/ml组与对照组相比差异具有显著性(P0.05)。 3、Western Bolt检测结果显示,p-Akt、Akt和GADPH在60 kD和36 kD表达,免疫印迹条带清晰。25ng组和50ng组p-Akt/Akt表达明显高于对照组,差异具有显著性(P0.01,P0.05)。100ng组和150ng组与对照组相比没有变化。 结论： 1. Desmin抗体鉴定表明本研究所采用的Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶两步消化加两次重复差速贴壁的方法成功地获取了骨骼肌卫星细胞。 2.MGF干预卫星细胞后发现,25ng/ml和50ng/ml的MGF对骨骼肌卫星细胞具有很好的促增殖作用。 3. Western Bolt结果显示,25ng/ml和50ng/ml组Akt和p-Akt的表达上调,MGF诱导的肌卫星细胞的增殖可能是通过Akt信号转导通路。

【关键词】：骨骼肌卫星细胞 细胞增殖 机械生长因子 蛋白激酶B
【学位授予单位】：上海体育学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：G804.2
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