机械生长因子对骨骼肌卫星细胞的增殖作用及作用途径的初步研究

【摘要】： 目的：卫星细胞和生长因子在骨骼肌的生长发育、训练适应、损伤修复及移植中均具有重要的作用。但由于活化的单个卫星细胞数量较少,且卫星细胞本身具有趋向融合的功能,因此如何使卫星细胞增殖到所需数量是有待解决的关键问题。机械生长因子(MGF)作为胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的一个亚型,有促进卫星细胞增殖,抑制分化的功能,因此利用外源性MGF类物质对卫星细胞进行干预,探讨MGF对肌卫星细胞的增殖作用及其可能的作用途径,为肌原性疾病的治疗提供新的思路。 方法：选用雄性SD大鼠1只,无菌条件下取后肢肌肉,采用改进的两步酶消化法结合差速贴壁技术,分离及纯化骨骼肌卫星细胞。取第3代骨骼肌卫星细胞,分别用终浓度为15、25、50、100、200ng/ml MGF进行干预,作为实验组；以单纯加入100μl生长培养基作为对照组,以加入100μl DMEM作为阴性对照组。同步化后,于培养24h后加入CCK-8溶液。CCK-8比色法检测细胞增殖情况并绘制生长曲线,同时运用BCA法及Hoechst 33342、PI双染法测定该浓度MGF对卫星细胞蛋白合成及细胞凋亡的影响。免疫细胞化学法鉴定骨骼肌卫星细胞。另取第3代骨骼肌卫星细胞,随机分为生长培养基对照组、DMEM对照组和实验组(MGF组、LY+ MGF组、PD+ MGF组、LY+PD+ MGF组),每组细胞6个样本,全部细胞在不含血清的生长培养基中分化培养3d后,相应组细胞换用含有PI3K特异性抑制剂LY294002(30μM)及MEK特异性抑制剂PD98059(50gM)的生长培养基预阻断12h后,再用含有MGF (25ng/ml)的生长培养基继续培养2d后,用ELISA法检测骨骼肌卫星细胞的CK-MM含量,同时用CCK-8法、BCA法观察不同培养条件下SC的增殖及蛋白质合成特性。 。结果：(1)MGF促进骨骼肌卫星细胞增殖的量效关系：除200ng/ml外,其他浓度的MGF均有促进骨骼肌卫星细胞增殖的作用(p0.01),其中25ng/ml时其促增殖作用接近顶峰。 (2)对照组骨骼肌卫星细胞第6d开始增殖速度明显减慢,细胞进入增殖的平台期,而MGF组骨骼肌卫星细胞第5d即达生长高峰,进入平台期。与对照组相比,MGF组细胞生长曲线左移,倍增时间、平台期均缩短。 (3)与对照组相比,随培养时间的延长,25ng/ml MGF作用48h即对骨骼肌卫星细胞有明显的增殖效果(p0.05)；与对照组相比,25ng/ml MGF作用骨骼肌卫星细胞48 h和72h时,其总蛋白含量增加(p0.05)；从两组平均凋亡指数的统计学比较结果可以看出,与对照组相比,25ng/ml MGF作用48h、72h,骨骼肌卫星细胞的凋亡程度显著被抑制(p0.05,p0.01)。 (4)与MGF组相比,LY+PD+MGF组细胞CK-MM表达明显受到抑制(p0.05),而LY+MGF组和PD+MGF组细胞CK-MM变化不显著；与MGF组相比,PD+MGF组和LY+PD+MGF组细胞CCK-8 OD值均有明显的下降(p0.01),而LY+MGF组细胞OD值下降不明显。 结论：(1)机械生长因子可促进体外培养的大鼠骨骼肌卫星细胞增殖,且最佳促增殖浓度为25ng/ml; (2) 25ng/ml MGF可以使骨骼肌卫星细胞提前进入平台期,缩短生长周期；(3)25ng/ml MGF可以抑制骨骼肌卫星细胞的凋亡； (4)骨骼肌卫星细胞离体培养发现,PD98059在抑制MGF对肌卫星细胞的增殖方面起到关键的作用,即MGF可能主要通过MEK/Erk途径调控卫星细胞的增殖；而细胞内信号相互交织的作用,使得PD98059和LY294002的联合使用,抑 制骨骼肌卫星细胞的增殖更为明显。