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《南京大学》 2011年
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RNA干扰逆转HeLaB2/DDP细胞顺铂耐药的研究

王庆晓  
【摘要】:肿瘤细胞的多药耐药(multidrug resistance, MDR)现象已成为肿瘤化疗失败的主要原因,因而逆转MDR是克服肿瘤临床耐药,有望提高化疗效果的重要手段。有关MDR形成机制主要为多药耐药基因mdr-1及其编码的糖蛋白P-glycoprotein(P-gp)的表达,而凋亡抑制基因bcl-2及其编码的Bcl-2蛋白也与癌症治疗及耐药有关。RNA干扰(RNAi)在转录后对靶基因进行调节,而发挥抑制作用,成为高效低毒的基因治疗方法,也为逆转耐药提供新途径,本实验探讨RNAi技术进行多药耐药逆转的可行性。 在本实验中,采用逐步递增顺铂(Cisplatin, DDP)浓度、体外间歇诱导法诱导人子宫颈癌Bcl-2高表达细胞株HeLaB2,建立顺铂耐药细胞株HeLaB2/DDP。我们针对bcl-2基因设计并合成了靶向同一序列的不对称小干扰RNA (asymmetric interfering RNA, asiRNA) (简称19/21b)和对称的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)(简称21/21b),另外,又针对mdr-1基因设计并合成了两个不同靶向序列的对称的siRNA(简称21/21m和23/23m)。通过转染小干扰RNA(siRNA或asiRNA)后观察其对HeLaB2/DDP细胞的bcl-2基因及其表达产物Bcl-2蛋白、mdr-1基因和及其表达产物P-gp蛋白的影响,以探讨其与多药耐药的关系。CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8)检测转染小干扰RNA (siRNA或asiRNA)后对HeLaB2/DDP细胞增殖的抑制作用,并计算耐药指数。实时荧光定量PCR法(RT-PCR)检测转染小干扰RNA (siRNA或asiRNA)后对HeLaB2/DDP细胞bcl-2基因和mdr-1基因的表达水平。流式细胞仪检测转染小干扰RNA (siRNA或asiRNA)后对HeLaB2/DDP细胞Bcl-2蛋白和P-gp蛋白的表达水平。mircoRNA芯片检测HeLaB2细胞在耐药过程中miRNA表达谱的变化以及转染19/21b后对mircoRNA表达谱的影响。 实验结果显示:1.HeLaB2/DDP细胞分别转染bcl-2和mdr-1的siRNA或asiRNA均可特异性抑制肿瘤细胞相应靶基因mRNA和靶蛋白的表达,同时HeLaB2/DDP细胞增殖受到抑制,IC50值明显降低。2.联合转染asiRNA(19/21b)和siRNA(23/23m),细胞的IC50值进一步下降,与分别转染组相比有统计学差异(P0.05),说明对化疗药物顺铂的敏感性提高。3.部分耐药所产生的microRNA的变化又恰恰通过转染19/21b的作用所逆转,使部分mircoRNA的值恢复到原有水平,提示这部分能逆转的mircoRNA可能参与了调控bcl-2基因的表达或与耐药机制相关,其调控机制还有待进一步研究。
【学位授予单位】:南京大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R73-3

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