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《南京大学》 2011年
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小分子化合物bis-N-norgliovictin调控TLR4信号通路的研究

宋玉仙  
【摘要】:Toll样受体(Toll like receptors, TLRs)在哺乳动物的免疫系统中发挥着会重要作用。它们识别不同的微生物进而激活天然免疫和获得性免疫系统,控制机体的免疫反应。其中TLR4介导的免疫反应的异常活化与许多难治性疾病(如:肿瘤、病毒感染、自身免疫病等)的发生发展密切相关,而临床上针对这一通路的治疗药物非常有限。因此,发现新的调控TLR4信号通路的小分子化合物,并深入研究其调控特点与机制,将有可能开发出新的药物,为这些疾病的治疗带来新的希望。 脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是TLR4最典型的配体,能激活TLR4信号通路,产生大量炎性因子。于是我们建立了LPS诱导的小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7模型,通过流式细胞术胞内因子检测的方法,从一系列海洋来源的共生菌产物中筛选能抑制该模型肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)产生的小分子化合物。我们筛选出几个化合物能抑制TNF-α和MCP-1的表达,其中化合物bis-N-norgliovictin(来自海洋真菌的二酮哌嗪类化合物)效果最明显。基于此,我们对bis-N-norgliovictin抗炎作用的特点和机制进行了进一步探索。 首先,我们用CCK-8试剂检测细胞活力,发现bis-N-norgliovictin (0.5~16μg/ml)对RAW264.7细胞的活力无影响,说明bis-N-norgliovictin的抗炎作用与其细胞毒性无关;接着,用ELISA或流式细胞术分析不同浓度bis-N-norgliovictin (0.5、1、2μg/ml)对LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α、IL-6、MCP-1和IFN-β产生的影响。结果显示,bis-N-norgliovictin对这些炎性因子均有不同程度的抑制作用;荧光定量PCR分析结果表明,bis-N-norgliovictin剂量依赖性地抑制炎性炎性因子mRNA的表达水平;同时,我们还发现bis-N-norgliovictin对小鼠腹腔巨噬细胞和LPS诱导的小鼠炎症模型具有类似的抗炎作用。流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞对FITC-LPS的结合和内吞能力,发现bis-N-norgliovictin (0.5、2μg/ml)对其并无影响,说明,bis-N-norgliovictin不改变巨噬细胞的信号识别和吞噬功能。 TLR4诱导两条不同的信号通路,分别由MyD88和TRIF来介导。其中MyD88依赖的信号通路主要经过MAPKs和NF-κB,最终产生致炎因子(如TNF-α、IL-6); TRIF依赖的信号通路除上述MAPKs和NF-κB外,还经过干扰素调节因子3(IRF3),最终产生Ⅰ型干扰素和干扰素诱导基因(如IFN-β、IP-10)。上述实验结果已表明,bis-N-norgliovictin对MyD88和TRIF依赖的两条通路的产物都有抑制作用,这就提示我们,该化合物可能对这两条通路都起调控作用。接下来我们从这两条通路出发研究bis-N-norgliovictin的作用机制。 用Western Blot法分析RAW264.7细胞NF-κB上游IκBα的磷酸化水平和降解情况,结果显示,bis-N-norgliovictin (2μg/ml)能显著下调LPS诱导的IκBα的磷酸化和降解水平;免疫荧光法观察到bis-N-norgliovictin减少LPS诱导的NF-κB的入核;同时,bis-N-norgliovictin能显著抑制LPS诱导的MAPKs中JNK和p38的磷酸化,而对ERK的磷酸化几乎不影响;荧光报告基因检测发现,bis-N-norgliovictin降低LPS诱导的AP-1的活性;另一方面,bis-N-norgliovictin对LPS诱导的RAW264.7细胞IRF3的磷酸化也起一定的抑制作用。 综上所述,筛选出的小分子化合物bis-N-norgliovictin能有效抑制TLR4介导的巨噬细胞炎症通路的活化,对TLR4通路中MyD88和TRIF两条途径均有下调作用。所有结果提示,bis-N-norgliovictin是一个新的TLR4通路的小分子抑制剂,它有可能成为治疗TLR4相关疾病的候选化合物。
【学位授予单位】:南京大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R392.1

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