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《南京大学》 2011年
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多孔硅表面增强亲和捕获蛋白及激光解析电离质谱检测

颜红  
【摘要】:蛋白质组学是后基因时代研究生物体系的一个重要方向。蛋白质组学的研究对象包括一种细胞、组织乃至一种生物所表达的全部蛋白质。和基因组学不同,蛋白质组学不是一个静态的概念,而是动态地表现了细胞基因以及时间、空间、周围环境对蛋白质的表达、修饰、空间位置和蛋白相互作用的综合影响。和基因组学相比,蛋白质组学对生物物质状态的研究更接近实用。因此,在对疾病的研究(发生、恶化)以及临床的诊断治疗方面,比基因分析能够提供更有用的信息。蛋白质组学的主要任务是分离分析整个蛋白质组,用统计学和生物信息学方面的知识通过对大规模数据的处理得到有意义的信息。因此,通过高通量的方式最大程度的研究蛋白质组是蛋白质组学的一个主要目标。结合高通量的方法对蛋白质表达水平差异的检测方法学已经应用到这一目标,例如自动样品处理和基质辅助激光解析电离时间飞行质谱(MALDI-TOF MS)的结合。一个比较成功的例子就是MALDI MS技术的发展,表面增强激光解析电离质谱(SELDIMS)。它结合了样品预处理和质谱检测使得样品的在线捕获、检测成为可能。该方法简化了质谱样品的准备步骤,减少了对样品处理的要求。SELDI MS逐渐发展成蛋白芯片系统,亲和捕获不同蛋白的各种芯片表面已经被发展了,包括用来捕获不同分子的色谱基质的化学表面和用来亲和捕获单个或一类特殊分子的特异性生物分子亲和表面。多孔硅因其比表面积大,制备过程简单并且和商业化的仪器兼容等优点而引起了广泛的关注。本论文描述了基于多孔硅表面的亲和捕获芯片的制备及其激光解析电离质谱检测。详细阐述了银纳米粒子沉积的多孔硅表面、固定金属亲和捕获衍生的银纳米粒子/多孔硅表面以及抗体固定的免疫亲和多孔硅表面的制备及其在激光解析电离质谱中的应用。 第一章介绍了蛋白质组学技术、蛋白微阵列技术(包括其类型、检测方法、基底材料、多孔硅材料)、MALDI-TOF MS(离子化原理、应用、分析样品预处理及整合的选择性富集靶ISET)、SELDI MS(表面增强解析电离、表面亲和捕获解析电离) 第二章描述了改进的多孔硅表面解析电离质谱方法。通过多孔硅表面的硅氢将银离子还原并沉积在多孔硅上用于激光解析电离。在硝酸银的溶液中引入对氨基苯硫酚降低了银纳米粒子在多孔硅表面的沉积速度同时将对氨基苯硫酚自组装到银纳米粒子表面。与多孔硅表面相比,银纳米粒子沉积的多孔硅以及吸附了对氨基苯硫酚的银纳米粒子/多孔硅表面在对小分子的激光解析电离中都显示出更高的稳定性、灵敏度以及更好的重复性。 第三章通过表面化学修饰发展了一个固定金属亲和捕获衍生的表面:NiⅡ-NTA衍生的银纳米粒子/多孔硅表面,用于从高浓度的盐、变性剂的缓冲体系中纯化组氨酸标记的蛋白。 第四章结合多孔硅表面抗体-抗原免疫亲和反应和微流控反相固体微萃取样品准备平台---整合的选择性富集靶ISET,从复杂的生物样品中捕获目标分析物并进行MALDI MS检测。3D结构的多孔硅,可以通过物理吸附将抗体直接固定在表面,不需要任何化学修饰,因此可将固定时间缩短至30-60分钟。材料本质的亲水性使该表面对复杂体系中的杂质产生很少的非特异性吸附;而3D结构的疏水性又使样品很好地被限制固定在很小的表面上。该方法能够从10微升稀释的血浆中将10 femtomol的血管紧缩素I捕获并通过MALDIMS检测出来,而且可以实现样品的自动化处理。
【学位授予单位】:南京大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:O629.73

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