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《南京大学》 2011年
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功能纳米材料信号放大用于高灵敏多通道电化学免疫分析

赖国松  
【摘要】:将抗原-抗体特异性反应与电化学传感技术相结合发展起来的电化学免疫传感器具有选择性好、灵敏度高、实时输出、操作方便、成本低廉且易于实现微型化等优点,在临床诊断、药物分析、环境和食品质量监控等领域得到了广泛应用。与单组份免疫分析方法相比,基于电极阵列建立起来的多通道电化学免疫传感器具有更高的分析效率和检测通量,将其与功能纳米材料信号放大技术相结合,可建立起在癌症早期筛查和诊断中具有重要应用前景的高灵敏多通道电化学免疫分析新方法。本论文围绕免疫传感器阵列和功能纳米探针的制备,以及基于纳米信号放大的高灵敏多通道电化学免疫分析新方法的建立,开展了以下几个方面的工作: 1、一次性免疫传感阵列上葡萄糖氧化酶功能化硅纳米球信号示踪的肿瘤标志物高灵敏检测 利用制备的一次性免疫传感器阵列和示踪标记物发展了一种检测肿瘤标志物的高灵敏电化学免疫分析方法。该传感器阵列以丝网印刷碳电极为基底,通过在电极表面修饰的碳纳米管(CNTs)-壳聚糖膜来组装金纳米粒子(Au NPs)并固定捕获抗体制备而成。示踪标记物通过将信号抗体和高含量的葡萄糖氧化酶(GOD)固定于氨基硅球上制得。基于夹心免疫分析模式,免疫反应捕获的标记物上的GOD可以在二茂铁羧酸电子媒介作用下实现酶催化信号放大;结合电极表面CNTs的电子传递促进作用,从而得到了该分析方法的较高灵敏度。利用癌胚胎抗原和甲胎蛋白作为模型分析物,该方法可在较宽浓度范围内实现对这两种分析物的同时测定,检测限分别低达3.2和4.0 pg/mL。该免疫传感阵列具有良好的稳定性和重复性。将该方法用于临床血清样品分析,测定结果与参考值较好吻合,表明该方法在多组分同时检测临床分析中具有较好应用前景。 2、葡萄糖氧化酶功能化纳米示踪复合物双信号放大用于肿瘤标志物高灵敏多通道检测 制备了一种可用来标记信号抗体的葡萄糖氧化酶(GOD)功能化纳米复合物,将其用作免疫分析示踪标记物,在一次性免疫传感器阵列上实现了对肿瘤标志物的高灵敏多通道测定。该免疫传感器阵列通过在丝网印刷碳电极上层层组装普鲁士蓝(PB)、Au NPs及捕获抗体制备而得。GOD功能化纳米复合物及抗体标记通过在负载Au NPs的碳纳米管(CNTs)上“一锅法”组装GOD及信号抗体制备而成。免疫传感器表面固定的PB可用作催化还原酶反应循环中产生的过氧化氢的媒介体。示踪物上高浓度的GOD及CNTs可在夹心免疫分析中实现对检测信号的双重放大。以癌胚胎抗原和甲胎蛋白作为模型分析物,使用该免疫传感器阵列和设计的示踪复合物建立起来的多通道免疫分析方法可在3个数量级线性范围内实现对两种分析物的高灵敏检测,检测限分别低达1.4和2.2 pg/L。将该方法用作血清样品中分析物测定,结果与参考值较好吻合。用作双重信号放大的该GOD功能化纳米复合物在高灵敏多组分临床分析领域具有较好的应用前景。 3、基于金纳米粒子及酶反应催化银沉积电化学溶出分析的高灵敏多通道免疫检测 在一次性免疫传感器阵列上,结合碱性磷酸酶标记抗体(ALP-Ab)功能化AuNPs和ALP-Au NPs催化银沉积发展了一种高灵敏多通道免疫分析方法。该传感器阵列通过在壳聚糖修饰的丝网印刷碳电极上共价固定捕获抗体制得。结合夹心免疫反应,在传感器表面捕获的ALP-Ab/Au NPs可催化水解3-吲哚磷酸酯生成吲哚中介体,该中介体可还原Ag+产生银沉积。ALP和Au NPs均可以催化该银沉积过程,从而放大检测信号。沉积的Ag NPs可以通过阳极溶出法在KCl溶液中进行灵敏检测。利用人和小鼠ⅠgG作为模型分析物,该多通道免疫分析方法可在超过4个数量级的较宽线性范围内实现对这两种蛋白的多通道检测,检测限分别低至4.8和6.1 pg/mL。将该方法用于实际样品分析,取得较好结果。本工作设计的这种分析策略可排除电化学免疫分析中的交联响应和除氧操作,因此在临床分析中具有一定的应用前景。 4、结合金标记物诱导银沉积及其电化学溶出分析的高灵敏多通道肿瘤标志物检测 结合一次性免疫传感器阵列发展了一种基于Au NPs标记物催化银沉积的电化学溶出分析的多通道电化学免疫分析方法,实现了对肿瘤标志物的同时高灵敏检测。免疫传感器阵列通过在壳聚糖修饰的丝网印刷碳电极上共价固定捕获抗体制得。通过夹心免疫反应,抗体功能化的Au NPs可以被捕获到传感器表面并进一步诱导银沉积。沉积的Ag NPs可以在KCl溶液中直接通过阳极溶出分析进行检测。银沉积过程和在KCl溶液中得到的尖锐对称溶出伏安峰都大大放大了检测信号,且较正的溶出分析电位范围还排除了溶解氧的干扰。利用甲胎蛋白和癌胚胎抗原作为模型分析物,该方法可在三个数量级宽的浓度范围内实现对二者的灵敏检测,检测限分别低至3.5和3.9 pg/mL。本方法中工作电极表面独立的银沉积和溶出过程完全避免了相邻免疫传感器之间的交联响应。该免疫传感器具有可接受的稳定性、重复性和准确度,因而在临床应用多组分分析中具有较好的应用前景。 5、链霉亲和素功能化碳纳米管/银纳米粒子标记物信号示踪的肿瘤标志物高灵敏多通道检测 设计了一种链霉亲和素功能化碳纳米管/银纳米粒子(CNT/Ag NP)复合物,将其用作免疫分析的示踪物在一次性免疫传感阵列上实现了对肿瘤标志物的高灵敏多通道检测。该CNT/Ag NP纳米复合物通过在羧基化CNT上“一锅法”原位沉积Ag NPs制得。通过蛋白质和Ag NPs间的特异性作用,将链霉亲和素功能化于该纳米复合物上来结合生物素化信号抗体得到标记抗体。该功能化过程提高了纳米复合物在溶液中的分散性和稳定性。免疫传感器阵列通过在壳聚糖修饰的丝网印刷碳电极上共价固定捕获抗体制得。通过在该免疫传感器阵列上的夹心免疫反应,结合在每个免疫复合物上的大量Ag NPs可进一步诱导银沉积来放大Ag NPs的电化学溶出分析信号。利用癌胚胎抗原和甲胎蛋白作为模型分析物,该免疫分析方法可在超过4个数量级线性范围内实现对这两种蛋白的灵敏检测,检测限分别为0.093和0.061 pg/L,且具有较好的精密度。将该方法用于血清样品检测,分析结果与参考值较好吻合。本工作设计的检测策略和功能化示踪物可排除电化学免疫分析中的交联响应和除氧操作,在临床应用中具有一定的应用前景。
【学位授予单位】:南京大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:O657.1

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