骨髓间充质干细胞治疗糖尿病性勃起功能障碍的实验研究及机制探索

【摘要】：勃起功能障碍(erectile dysfunction, ED)是糖尿病常见的并发症,糖尿病男性患者中ED的发生率比非糖尿病患者高3倍。5型磷酸二酯酶抑制剂(type5phosphodiesterase inhibitor, PDE5I)是治疗ED的一线口服药物,也是目前治疗糖尿病性ED的主要方法,但是由于糖尿病性ED发病机制复杂,PDE5I治疗糖尿病性ED的效果不甚理想。故探索治疗糖尿病性ED的新方法是十分重要的临床意义。骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)是存在于骨髓组织中的一种成体干细胞,在一定的条件下BM-MSCs也向多种组织细胞分化,BM-MSCs还能分泌多种营养因子促进组织生长。前期已经有研究证实BM-MSCs能够改善老年大鼠及勃起神经损伤性大鼠的勃起功能,但BM-MSCs改善勃起功能的具体机制并不十分明确。本课题使用BM-MSCs海绵体内注射治疗糖尿病性ED,并探索BM-MSCs提高糖尿病大鼠勃起功能及改善糖尿病大鼠阴茎海绵体组织结构的可能机制。 第一部分：BM-MSCs海绵体内移植治疗糖尿病性ED 目的：探索BM-MSCs阴茎海绵体内注射提高链脲佐菌素(STZ)诱导的I型糖尿病大鼠勃起功能的效果。 方法：雄性Sprague Dawley大鼠腹腔注射STZ诱导糖尿病大鼠模型,对照组大鼠仅注射缓冲液。分离、培养BM-MSCs并在糖尿病模型成模8周后移植到糖尿病大鼠阴茎海绵体内。移植4周后测定大鼠勃起功能并对阴茎海绵体组织进行组织学分析。电刺激大鼠勃起神经并记录海绵体内压(intracavernous pressure, ICP),使用ICP与平均动脉压(mean arterial pressure, MAP)的比值来评估大鼠勃起功能。免疫组化染色来测定大鼠阴茎海绵体组织中平滑肌和内皮的含量。马松三色染色测定大鼠阴茎海绵体组织的纤维化情况。 结果：BM-MSCs阴茎海绵体内移植后,治疗组大鼠ICP/MAP较糖尿病对照组明显提高。治疗组大鼠阴茎海绵体内平滑肌和内皮的含量较糖尿病对照大鼠也有明显的提高。同样,治疗组大鼠阴茎海绵体内纤维化程度较对照组大鼠有所降低。结论：阴茎海绵体内移植BM-MSCs对于改善糖尿病大鼠勃起功能并提高海绵体组织中内皮和平滑肌的含量有一定的效果。 第二部分：BM-MSCs海绵体内移植治疗糖尿病性ED的机制探索 目的：探索BM-MSCs提高链脲佐菌素(STZ)诱导的I型糖尿病大鼠勃起功能的可能机制。 方法：雄性Sprague Dawley大鼠腹腔注射STZ诱导糖尿病大鼠模型,将糖尿病大鼠随机分为三组：糖尿病对照组,BM-MSCs治疗组和BM-MSCs条件培养基治疗组。BM-MSCs阴茎海绵体内移植后1天,3天,1周,2周分别随机从BM-MSCs台疗组抽取3只实验大鼠,取大鼠阴茎海绵体组织寻找BM-MSCs。BM-MSCs移植后4周,电刺激勃起神经记录阴茎海绵体内压(ICP)评估大鼠勃起功能。免疫荧光染色测定大鼠阴茎背神经中神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)和神经丝(Neurofilament, NF)的表达。免疫荧光染色鉴定BM-MSCs的分化情况。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测定BM-MSCs条件培养基中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),神经生长因子(nerve growth factor, NGF)和脑源性神经生长因子(Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF)的浓度。 结果：BM-MSCs能够合成、分泌一定量的VEGF, BDNF和NGF。阴茎海绵体内移植BM-MSCs能够改善糖尿病大鼠勃起功能并提高阴茎背神经内nNOS和NF的含量。组织学结果显示,BM-MSCs阴茎海绵体内移植后,随着时间的推移,阴茎海绵体内BM-MSCs的数量逐渐减少。移植后第4周,阴茎海绵体内的BM-MSCs数量有限,但部分BM-MSCs能够表达内皮细胞特异性抗原CD31和vWF,部分BM-MSCs能够表达平滑肌细胞特异性抗原α-SMA以及calponin。更重要的是,BM-MSCs条件培养基也具有改善糖尿病大鼠勃起功能和阴茎海绵体组织结构的作用,BM-MSCs提高勃起功能,改善阴茎组织结构的作用能够部分被BM-MSCs条件培养基所代替。结论：阴茎海绵体内移植BM-MSCs对于改善糖尿病大鼠勃起功能有一定的效果。移植后BM-MSCs能够向平滑肌样细胞和内皮样细胞分化。旁分泌作用可能是BM-MSCs改善糖尿病大鼠勃起功能另一个重要的可能机制。 第三部分：BM-MSCs海绵体内移植联合VEGF基因治疗糖尿病性ED 目的：探索BM-MSCs阴茎海绵体内移植联合VEGF基因治疗改善链脲佐菌素(STZ)诱导的I型糖尿病大鼠勃起功能的效果。 方法：雄性Sprague Dawley大鼠腹腔注射STZ诱导糖尿病大鼠模型,糖尿病大鼠随机分为三组：糖尿病对照组,BM-MSCs治疗组,VEGF164腺病毒转染BM-MSCs台疗组。阴茎海绵体内注射4周后,电刺激勃起神经记录海绵体内压评估大鼠勃起功能,取大鼠阴茎组织用于组织学观察和ELISA测定。 结果：阴茎海绵体内注射前,ELISA测定结果显示VEGF164基因转染的BM-MSCs能够高水平表达VEGF。阴茎海绵体内注射4周后,治疗组大鼠勃起功能,阴茎海绵体内平滑肌和内皮含量较糖尿病对照组明显提高,而VEGF164基因改造的BM-MSCs对于改善糖尿病大鼠勃起功能及海绵体组织结构的效果更加明显。ELISA结果显示VEGF164基因改造的BM-MSCs阴茎海绵体内移植能够增加大鼠阴茎海绵体组织内VEGF的水平。 结论：BM-MSCs阴茎海绵体内移植联合VEGF基因治疗能够提高BM-MSCs治疗糖尿病性ED的效果。