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适配体功能化的荧光纳米探针用于蛋白和细胞传感研究

李菁菁  
【摘要】:分子特异性识别与信号输出的有机结合是目标物检测和生物标记成像的基础。自20世纪90年代核酸适配体概念提出以来,经过近30年的研究,它已发展成为一类备受关注的新型识别分子,在化学、生物医学、纳米材料、物理等学科中的应用也引起了研究者的广泛关注。另一方面,荧光纳米材料如量子点、金属纳米簇优越的荧光性能被作为信号输出分子而广泛用于生物技术领域,如DNA检测、免疫荧光检测以及细胞和动物生物学中。在本论文工作中,结合适配体的特异性识别能力和荧光纳米材料良好的光学性能,设计构建了新型的蛋白和细胞传感器。通过制备适配体功能化的荧光纳米探针实现细胞特异性染色及对传统蛋白免疫印迹方法的改良。其内容如下:1.基于适配体-量子点结合物的竞争型电化学细胞传感器的构建以适配体-量子点结合物为平台构建了一种竞争型电化学细胞传感器并用于肿瘤细胞的识别和检测。互补DNA (cDNA)、适配体和量子点自组装至金电极表面,当目标细胞存在时,基于适配体与细胞表面过量表达的MUC1蛋白间的特异性识别作用,它们能够与cDNA发生竞争反应从而使得双链DNA解旋,适配体-量子点结合物从电极表面被释放出来,随后通过电化学溶出方法来检测残留在电极表面的量子点中Cd2+的浓度,得到的峰电流强度在1.0×102~1.0×106cells mL-1范围内与细胞浓度的对数成反比,检测限为100 cells mL-1。同时,适配体对目标细胞的识别作用能够清晰地通过量子点的荧光发射观察到。这对于癌症的诊断和治疗有重要的作用。2.基于适配体-量子点结合物的蛋白免疫印迹用于多蛋白检测利用适配体的特异性识别能力和量子点可调控的荧光成像构建了新型蛋白免疫印迹来实现多种蛋白的同时检测。凝血酶、人血小板衍生生长因子(PDGF-BB)和DNA结合蛋白(SSB)能够从单一的蛋白免疫印迹上同时检测,并呈现出红色、绿色和橙色条带。通过PEG修饰量子点和随机DNA序列的封闭,显著改善了适配体-量子点结合物在复杂样品中的非特异性吸附,目标蛋白甚至可以在十倍稀释的人血清样品中选择性地检测出来。该工作表明,基于适配体-量子点结合物的蛋白免疫印迹在蛋白检测特别在复杂样品检测中具有很强的应用潜力。3.利用适配体功能化的银纳米簇DNA探针构建结合诱导荧光恢复体系检测蛋白适配体与目标蛋白的结合促使DNA杂交反应的发生,从而引起银纳米簇的荧光增强,基于该原理构建了人凝血酶的均相检测体系。人凝血酶适配体Apt15和Apt29分别在5’端和3’端修饰上不同的功能序列,如银点的生成序列、互补序列以及富含鸟嘌呤的DNA序列。两条适配体链对目标蛋白的识别结合促使杂交反应的进行从而使得富含鸟嘌呤的DNA序列靠近银点而产生荧光增强信号。该均相体系用于凝血酶检测无需额外的清洗和分离步骤,只需要简单的“加入混合”就足够了。此原理可以拓展到其他均相体系的应用中。4.利用适配体功能化的银纳米簇DNA探针构建均相竞争型荧光体系用于蛋白检测以富含鸟嘌呤的DNA序列靠近银点时的荧光增强以及目标蛋白与适配体的竞争结合导致的荧光猝灭为基础,提出了一个均相竞争型荧光体系用于蛋白检测。系统地研究了影响该体系灵敏度和选择性的一些重要因素,比如杂交数目、间隔序列长度、探针比例和缓冲液条件。在最佳的条件下,以人凝血酶为检测物,检测限能够达到25 pM。该荧光体系为均相反应,消除了传统体系中固定、分离、洗涤、猝灭剂或者增强剂的需要。只要求一个适配体作为识别分子使得该方法的普及具有一定的潜力。5.一步法制备适配体功能化的银纳米簇及其在细胞特异性成像中的应用通过一步反应制备了AS1411功能化的银纳米簇。共聚焦扫描电镜和z轴扫描证实AS1411功能化的银纳米簇能够内化到MCF-7乳腺癌细胞内部并且特异性地将细胞核染成红色。特别地,MTT实验表明该银纳米簇细胞毒性小并且对MCF-7细胞的生长抑制效果比单纯的AS1411更好。同时,我们提出了合成适配体功能化银纳米簇的普遍方法。由于制备过程简单以及对目标物的特异性识别能力,该荧光平台能够扩大银纳米簇在生物传感和生物成像中的应用潜能。


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