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《南京大学》 2016年
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呼吸道合胞病毒感染诱导肺上皮细胞中IRG1表达及其意义

吕媛子  
【摘要】:呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)为负义单链RNA病毒,是导致婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体,主要引起哮喘,毛细支气管炎和肺炎。尽管炎症因子的大量产生被定义为RSV感染性疾病的主要诱因,越来越多证据表明,RSV感染过程中显著持续诱导产生的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),才是RSV感染诱导炎症因子和组织损伤的主要原因。免疫应答基因1(Immune responsive gene 1,IRG1)最初在脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞中发现,能够编码顺乌头酸脱羧酶,催化TCA循环中间产物顺乌头酸脱羧生成衣康酸,并能调控脂肪酸β-氧化生成线粒体ROS,从而参与天然免疫,发挥抗菌作用。多种细菌和病毒感染可以诱导IRG1的表达。本沦文主要研究呼吸道合胞病毒感染过程中IRG1基因的表达及其意义。我们发现,RSV感染A549细胞可以显著诱导IRG1基因的表达。我们通过基因敲除和过表达来研究IRG1在病毒感染过程中发挥的作用。尽管有文献报道IRG1具有一定抵抗ssRNA病毒的作用,过表达IRG1对RSV病毒复制并无明显影响,而用siRNA抑制IRG1表达可以抑制RSV病毒复制,下调炎症因子和mROS水平。同时,抗氧化剂NAC/GSH可以降低细胞内ROS水平,并有效抑制RSV病毒复制。谷胱甘肽抑制剂BSO能在一定程度上调细胞内ROS水平,对RSV复制并无影响。另外,我们发现,RSV感染显著上调A549细胞内葡萄糖摄取和糖酵解过程,敲除IRG1可以逆转RSV感染诱导的糖摄取,但是RSV感染并不导致衣康酸的积累。因此我们推测,RSV感染过程中通过上调IRG1表达,诱导线粒体ROS,引发疾病和组织损伤。敲除IRG1下调ROS水平,从而降低炎症因子表达及RSV病毒复制。RSV复制并不依赖于预先存在的IRG1及ROS。综上所述,本文首次证明了 RSV感染可以显著诱导IRG1表达,并且初步阐述了 IRG1基因在RSV感染过程中通过调控细胞内ROS产生的重要作用,这可能是RSV感染过程中引起氧化应激现象的潜在原因,而敲除IRG1可能作为抑制RSV病毒感染的新型治疗手段。
【关键词】:免疫应答基因(IRG1) 呼吸道合胞病毒(RSV) 活性氧(ROS)
【学位授予单位】:南京大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R373
【目录】:
  • 摘要6-8
  • ABSTRACT8-10
  • 缩略词10-12
  • 第一部分 文献综述12-32
  • 1. 呼吸道合胞病毒12-14
  • 1.1 呼吸道合胞病毒概述12-13
  • 1.2 呼吸道合胞病毒的基因组及其编码蛋白13-14
  • 1.3 呼吸道合胞病毒的复制14
  • 2. 免疫应答基因14-18
  • 2.1 IRG1基因概述15-17
  • 2.2 IRG1基因的功能研究17-18
  • 3. 氧化应激在病毒感染过程中发挥的作用18-24
  • 3.1 ROS诱导炎症因子表达19-20
  • 3.2 下调ROS作为治疗RSV感染的新型手段20-24
  • 参考文献24-32
  • 第二部分 RSV感染调控IRG1基因表达及其机制研究32-57
  • 1. 实验材料32
  • 1.1 细胞和病毒32
  • 1.2 抗体和试剂32
  • 2. 实验方法32-37
  • 2.1 病毒培养32-33
  • 2.2 病毒滴度TCID_(50)的测定33
  • 2.3 TRIzol法提取细胞总mRNA33
  • 2.4 实时荧光定量PCR33-34
  • 2.5 聚合酶链式反应34
  • 2.6 免疫印迹分析34-35
  • 2.7 RNA干扰及过表达实验35
  • 2.8 流式细胞术35-36
  • 2.9 免疫荧光36-37
  • 2.10 葡萄糖摄取率测定37
  • 2.11 GC-MS检测细胞样品制备37
  • 3. 实验结果37-52
  • 3.1 RSV感染诱导IRG1基因表达37-38
  • 3.2 敲除IRG1抑制RSV复制38-40
  • 3.3 过表达IRG1不影响RSV复制40-41
  • 3.4 IRG1调控RSV感染过程中ROS生成41-45
  • 3.5 还原剂/氧化剂通过调控RSV感染过程中ROS水平影响病毒复制45-47
  • 3.6 IRG1调控RSV感染过程中的糖代谢47-52
  • 4. 讨论52-54
  • 5. 结论54-55
  • 致谢55-56
  • 附录:已发表文章56-57

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1 吕媛子;呼吸道合胞病毒感染诱导肺上皮细胞中IRG1表达及其意义[D];南京大学;2016年
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