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《南京大学》 2015年
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EV71感染与应激颗粒以及RNA代谢通路之间的关系研究

王小辉  
【摘要】:病毒感染对细胞来讲,是一种应激。因此细胞内会形成应激颗粒以发挥对抗病毒感染的作用。但是细胞长期处于应激状态不利于病毒蛋白质的翻译和病毒颗粒的装配,因此,为了有效的合成蛋白和完成复制,病毒进化了一系列机制干扰SG的形成,有的病毒甚至利用SG的成分蛋白辅助自身复制。在本课题中,我们通过细胞免疫组化,RNApull down,病毒学试验,ELISA等方法,研究了 EV71感染后细胞的应激反应,及应激颗粒成分蛋白与病毒之间的相互作用及对病毒复制的影响。另外,P-小体是细胞中与SGs不同的一种颗粒性结构,在该研究中,我们研究了 P-小体与miRNA之间的关系,以及在病毒感染后P-小体的变化及对病毒复制的影响。主要研究内容如下:一.EV71感染可以抑制应激颗粒的形成,并影响HuR,TDP-43和FUS/TLS在细胞中的定位在该部分研究中,通过细胞免疫组化方法,我们发现在EV71感染后的早期,细胞内会形成大量的应激颗粒,而在病毒感染的中后期,即病毒蛋白开始大量表达后,形成的应激颗粒就会消失。eIF2α磷酸化后抑制宿主细胞翻译,是诱导形成SGs的经典途径之一,但是在该研究中我们发现,EV71感染后应激颗粒的形成与eIF2α的磷酸化无关,而与另一个应激颗粒的成分蛋白eIF4G的被切割有关。EV71感染后,有些患儿会表现出严重的神经症状,是EV71致死的主要原因。截至目前,EV71引起神经症状的原因仍不明了。在该研究中,我们发现,HuR,TDP-43和FUS/TLS在EV71感染后从胞核迁移至胞质,并形成SG样的颗粒性结构。通过RNA pull down实验证实,病毒基因组可与这三个蛋白相结合。另外,通过免疫共沉淀实验,我们发现TDP-43和FUS/TLS都可结合于HuR蛋白。此外,我们也利用Sandwich ELISA方法检测了 EV71感染后患儿体内的TDP-43水平,结果发现,EV71感染后,患儿血浆中TDP-43的水平明显高于未感染组。综合我们的研究结果,我们推测EV71感染后TDP-43和FUS/TLS的胞质定位是其引起神经系统疾病的原因之一。因此,我们的研究为EV71感染引起的神经紊乱提供了新的解释和治疗策略。二.EV71感染后,TIA-1和TIAR迁移至细胞质,结合于病毒基因组5,-UTR并促进病毒复制TIA-1及TIAR是SG的另外两个成分蛋白,可以结合至RNA的AU富集区。在多个层面调节细胞分化,凋亡和基因的剪接等生理活动。我们在本研究中通过免疫荧光,RNApulldown及病毒学试验,研究了 TIA-1和TIAR在EV71感染后定位的变化,这两种蛋白与病毒基因组之间的相互作用,及对病毒复制的影响。结果我们发现,在EV71感染后,TIA-1及TIAR从胞核迁移至胞质并定位于病毒复制位点。RNA pull down试验证实,二者都结合于病毒基因组5'-UTR的第一个四叶草状的颈环结构。但是这种结合并不能促进病毒蛋白质的翻译,而能增加细胞中病毒基因组的数量。因此我们推测,TIA-1和TIAR结合到病毒基因组5'-UTR后可以促进病毒基因组的合成,或者抑制细胞RNA降解通路对病毒基因组RNA的降解。三.P-小体和应激颗粒通过影响microRNA通路,进而调节EV71病毒的感染和复制Dcpla和GW182是P-小体的成分蛋白。在之前的研究中发现,在miRNA对目标基因的调节中,二者都发挥着重要作用。在该研究中,我们通过基因过表达和免疫荧光研究发现,过表达Dcpla和GW182可在细胞中形成大量的颗粒,而过表达P-小体的其他成分,并不出现该现象。我们进一步检测了过表达的GW182和Dcpla是否与其他P-小体的成分共定位。结果发现,在细胞中,过表达的eGFP-Dcpla与DDX6共定位在一起,而GW182却没有,说明过表达GW182所形成的颗粒结构与过表达Dcpla所形成的颗粒结构成分不同。另外,我们通过表达G3BP1,在细胞中诱导形成了大量的应激颗粒。在G3BP1过表达诱导形成的颗粒中,可以超募TDP-43和eIF4G进入其中,而FUS/TLS并不被招募进颗粒中。我们还发现,Dcpla和G3BP1蛋白过表达后形成的颗粒会抑制细胞中的蛋白质合成。另外,通过转染荧光标记的miRNA-141,研究了 P-小体与应激颗粒之间的关系。结果发现,miRNA在细胞中可进入GW182,Dcpla和G3BP1过表达所形成的颗粒中。我们还发现,EV71感染后细胞中P-小体的数量明显增加。为了进一步验证P-小体对EV71复制的影响,通过RNAi技术敲除了部分P-小体的成分蛋白。结果发现,沉默任何P-小体的蛋白后,EV71的复制都会被抑制。说明P-小体和其中的成分蛋白在EV71感染过程中可以促进病毒的复制。总之,通过本课题的研究,我们初步建立了病毒感染与细胞应激以RNA代谢通路之间的关系;另外,我们还发现了两个与EV71病毒复制有关的ITAFs。该研究为EV71感染的防治提供了一定的理论依据。
【学位授予单位】:南京大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R511

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