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《南京大学》 2017年
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联合运用人工真皮与血管内皮生长因子浓度梯度在促进糖尿病猪模型伤口愈合中的作用

徐鹤然(Hok Yin Tsui)  
【摘要】:目的糖尿病(Diabetes mellitus,DM)患者的创面是世界范围内最常见的难愈性创面之一。影响这类创面不遵循正常有序的愈合进程的原因可分为内在因素和外在因素两个方面。内在因素包括:糖尿病导致的周围神经或血管病变和糖尿病严重程度。外在因素包括:创面感染,愈伤组织形成和对创面区域的过度压力。多重的异常致病因素相互作用,在糖尿病创面中形成恶性循环。此外,血流灌注的不足以及生长因子水平的下降,加上血管再生的受损使愈合过程更复杂化。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是最重要的促血管生成介质之一。它可作为促内皮细胞的分裂剂和趋化剂,同时诱导血管的通透性。在链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病小鼠创面模型研究中,发现几种生长因子合成的减少,其中就包括VEGF。在糖尿病患者中,低水平的VEGF导致血管密度的降低,肉芽组织形成的减少,最终延迟创面的愈合。足够水平的VEGF可以通过多种活性刺激创面的愈合,包括胶原沉积,血管生成和再上皮化。单独使用VEGF或与其他治疗方法联合,已被证明是糖尿病创面治疗的有效方法。人工真皮(Artificial dermal,AD)已经在人类和动物模型全层皮肤缺损创面的治疗中显示出巨大的潜力。本实验中使用的人工真皮由两层结构组成:上层为加强型的硅胶膜,下层为来源于猪肌腱的无末端胶原蛋白海绵层。它能有效诱导新生真皮样肉芽组织的形成,从而有效的改善创面的愈后。在我们之前的体外研究中,已经证明,一定浓度的VEGF可以促进血管内皮细胞的增殖和移行,而VEGF的浓度梯度模型可以促进血管内皮细胞的迁移。因此,在本研究中,我们尝试通过联合运用人工真皮和均一浓度的VEGF或VEGF浓度梯度来促进糖尿病猪模型的创面愈合。充分利用人工真皮和VEGF在改善创面愈合过程的优势。将人工真皮作为一个持续的VEGF给药系统。与此同时,比较不同均一浓度的VEGF和VEGF浓度梯度之间在疗效上的差异。材料与方法实验材料:将人工真皮切割成1cm×1cm的正方形碎片供测试其吸收性和缓释效率。剩余人工真皮被切割成其他两种形状以用于随后的动物模型手术:1型为直径18mm的圆,并准备浸入不同浓度的VEGF。2型为三个同心圆(H,M,L)。H:直径6mm。M:内径6mm,外径12mm。L:内径12mm,外径18mm。基于之前的体外研究,将型的同心圆分别浸泡于三种浓度的VEGF中。高浓度(H):100ng/ml。中等浓度(M):25ng/ml。低浓度(L):5ng/ml。从而建立VEGF内高外低的浓度梯度。实验方法1.挑选体重20-25公斤的健康实验用小型母猪只,以125mg/kg的剂量静脉内推注链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病动物模型。其中两只猪用于评估愈合率。另外四只用于随后的样本采集。2.在全麻下,每只猪的脊柱两侧制备36个全层皮肤缺损创面(直径18mm)。将这些创面随机分为6组:空白对照组(C,仅PBS,n=6),人工真皮组(AD,仅AD,n=6),低浓度组(AD+L,AD+5ng/mlVEGF,n=6),中浓度组(AD+M,AD+25ng/ml VEGF,n=6),高浓度组(AD+H,AD+100ng/mlVEGF,n=6),浓度梯度组(AD+G,AD+VEGF浓度梯度,n=6)。对照组以外的所有创面表面覆盖人工真皮膜片,与创面边缘缝合固定,并在外层打包固定。3.术后第7、14、21天计算伤口愈合率。在各时间对每个伤口进行拍摄,并通过图像分析软件进行分析。愈合率=[(原始创面面积大小-未愈合面积)/原始面积]×100%。4.将石蜡包埋的组织切成5μm厚的切片(HE)染色在100倍放大倍数下分析从创面中心部的肉芽组织。用anti-von Willebrand factor抗体对连续切片进行免疫标记,以检测肉芽组织的新血管形成水平。术后第21天的样本用anti-VEGF polyclonal抗体进行免疫标记。在400倍放大倍数下,定量VEGF蛋白特异性染色区域。VEGF蛋白特异性染色面积的百分比=VEGF蛋白阳性面积/总组织面积×100%。结果1.AD的吸收率为0.3ml/cm2。缓释效率前4天(第1天:24.96±2.38ng/ml,第2天:22.19±1.27ng/ml,第 3 天:20.20±1.62ng/ml,第 4 天:10.30±1.79ng/ml)。饱和 AD 连续释放VEGF,从第5天起,缓释效率明显降低(第5天:5.24±0.93ng/ml,第6天:1.80±0.34ng/ml),在第 7 天接近 0。2.动物模型维持持续高血糖状态(血糖在300至500mg/dl之间)稳定一周后,糖尿病猪模型成功建立。3.术后第7天,各组愈合率差异无统计学意义(P0.05)。AD+M组AD+H组和AD+G组在第14天,AD+H组和AD+G组在第21天的愈合率均明显高于对照组(P0.05)。4.术后第7天所有治疗组肉芽组织形成速度明显快于对照组。AD+H组和AD+G组中发现较厚的肉芽组织,与对照组相比高出2倍以上。但两组之间比较差异无统计学意义(P0.05)。在整个实验过程中,AD+H组和AD+G组的肉芽组织厚度均显著高于对照组(P0.05)。5.第7天,AD+H组(21.7±2.0每视野)和AD+G(19.6±1.6每视野)的血管密度显著高于对照组(4.2±1.0每视野)(P0.05)。AD组显示血管数量较少(5.0±1.1每视野)。在第14天和第21天,所有组的新血管形成水平不断增加。在实验中,AD+H组和AD+G组诱导血管生成数量最明显。6.与对照组相比,所有治疗组的VEGF蛋白特异性染色面积百分比均比较高。特别是AD+H组和AD+G组,显著高于对照组(P0.05),分别高于对照组3倍和2倍。结论人工真皮产品与足够浓度的VEGF组合具有促进糖尿病创面愈合的显著能力。其中,联合使用人工真皮和特定VEGF浓度梯度,使用较少的剂量,但达到相似的效果。这种组合可以促进新生血管发生,增加上皮化,最终加速糖尿病性创面的直接愈合,或为二期皮肤移植做好准备。这个治疗方法可能为是糖尿病创面治疗的提供一个新的思路。
【学位授予单位】:南京大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R587.2;R641

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