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《南京大学》 2017年
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神经导向因子(Netrin-1)参与缺血肠道微血管新生作用的研究

王凯  
【摘要】:研究目的:急性肠系膜缺血(acute mesenteric ischemia,AMI)作为一种致命性腹部血管危重症具有较高的死亡率。肠缺血初期表现为血管舒张,但随着缺血时间延长血管会发生收缩,并在肠管血运恢复后仍会持续存在。急性肠系膜缺血进一步加重可引起血管痉挛加剧、肠粘膜屏障功能受损、全身性炎症反应通路激活、局部缺血加重肠损伤,在不加干预的情况下甚至进一步发展为广泛肠坏死进而导致短肠综合征、多器官功能障碍(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)最终危及生命。尽管治疗技术不断发展,但对于已缺血的肠道的处理和治疗尚缺乏相应策略,只能待肠管坏死后予以切除。因此对已缺血的肠道予以充分保护,促进其缺血后血供和功能的恢复,最大程度上减少肠坏死的发生尤为重要。在打通肠系膜血管主干之后,微血管新生对于缺血肠道的功能恢复具有重要意义。有研究发现,血管生成和神经轴突生长具有一定相似性,引导神经定向生长的神经导向因子(netrin-1)能诱导血管生长。本研究旨在探究netrin-1在急性肠系膜缺血肠道及缺氧细胞中的表达及微血管新生的机制和作用,为临床中急性肠系膜缺血后肠道保护治疗提供治疗靶点和理论依据。研究方法:第一部分:对数生长期人结直肠腺癌细胞(Caco-2)置于低氧培养箱培养(2%O2,5%CO2),分别培养 Oh,12h,24h,36h,48h,应用免疫印迹、Real-timePCR和免疫荧光技术检测不同低氧时间下Caco-2细胞Netrin-1 mRNA和蛋白的表达,探究不同低氧时间下Caco-2细胞Netrin-1的表达变化。第二部分:根据Vicrhow三要素,使用构建狭窄、损伤内皮和注射凝血酶的方法构建外周型和中央型急性肠系膜上静脉血栓形成(ASMVT)模型,模型临床中患者ASMVT的临床情景,同时构建仅分离肠系膜血管的假手术组,应用免疫印迹、Real-time PCR和免疫组化技术检测不同缺血模型肠道netrin-1表达差异以及netrin-1的表达与肠屏障功能的相关性。第三部分:收集ASMVT与正常肠管标本,应用免疫印迹、Real-time PCR和免疫组化技术检测缺血肠道netrin-1的表达,比较正常肠管与缺血肠管之间netrin-1表达的差异,探究netrin-1的表达量与肠道功能恢复和患者预后之间的关系。研究结果:第一部分:Caco-2细胞在低氧条件(2%02,5%C02)下,随着低氧时间延长,netrin-1的转录增加从而上调netrin-1 mRNA表达及蛋白表达水平,同时netrin-1蛋白的表达变化趋势与mRNA变化趋势相一致。第二部分:蛋白质免疫印迹结果提示中央型ASMVT组大鼠肠道netrin-1表达高于外周型ASMVT组,外周型ASMVT组Chu's肠粘膜病理评分、血I-FABP、内毒素水平均高于中央型ASMVT组。在SD大鼠ASMVT模型中,肠道组织netrin-1在mRNA及蛋白水平表达增加,与外周型ASMVT相比,中央型ASMVT模型netrin-1表达增加,肠屏障功能损伤较轻继发较轻的内毒素血症。第三部分:Real-time PCR和蛋白质免疫印迹结果提示缺血肠管中netrin-1表达高于正常肠管;根据ASMVT患者手术切除肠管标本免疫组化切片进行免疫反应总评分(IHC score),netrin-1高表达组患者肠切除长度相对更短,SBS发生率更低。研究结论:(1)随着低氧时间延长,Caco-2细胞中netrin-1的表达逐渐增加;(2)SD大鼠ASMVT模型中,肠道组织netrin-1表达增加促进微血管新生;(3)与外周型ASMVT相比,中央型ASMVT模型netrin-1表达更加明显,进而促进微血管新生,减轻肠屏障功能损伤及其继发的内毒素血症;(4)ASMVT患者手术切除肠管netrin-1高表达,netrin-1高表达组预后优于netrin-1低表达组。
【学位授予单位】:南京大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R572.3

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