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《南京大学》 2017年
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依托泊苷通过内质网应激诱导活化肝星状细胞的凋亡研究

王晨  
【摘要】:背景和目的:肝纤维化是各类损伤因素累及肝脏后的一种损伤修复反应,肝纤维化甚至肝硬化能否成功逆转是目前纤维化研究领域的焦点。肝星状细胞的活化在肝纤维化形成过程中起着至关重要的作用,静息的肝星状细胞活化后获得成纤维细胞表型,大量增殖并分泌过量的胶原,从而导致细胞外基质的过度沉积,因此,清除活化的肝星状细胞成为逆转纤维化的关键。在肝纤维化逆转过程中活化的星状细胞的去向主要包括凋亡、衰老及转换为静息表型,其中诱导活化的星状细胞凋亡被证实可减弱乃至逆转纤维化。依托泊苷(etoposide,VP-16)是广泛应用的化疗药物,在诸多肿瘤中可以表达出抗癌作用,然而其对肝星状细胞及肝纤维化的逆转作用尚不明确。我们的实验旨在探索依托泊苷对人肝星状细胞株LX-2增殖、凋亡的影响及可能的作用机制。方法:不同浓度的依托泊苷处理LX-2细胞,采用CCK-8法检测细胞增殖活性,JC-1染色检测线粒体膜电位,流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡水平,caspase-3活性检测试剂盒检测细胞caspase-3活性,蛋白质印迹法检测相关蛋白的表达水平,逆转录-聚合酶链反应检测纤维化相关因子RNA的表达水平。依托泊苷单独或联合caspase抑制剂、JNK抑制剂预处理LX-2细胞,采用CCK-8法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡水平,蛋白质印迹法检测相关蛋白的表达水平。将正常肝细胞株LO-2和QSG-7701处以相同浓度的依托泊苷,CCK-8法和流式细胞术检测细胞的增殖抑制率及凋亡率。结果:依托泊苷明显抑制LX-2细胞的增殖,使细胞周期停滞在G2/M期,且导致高水平的细胞凋亡。依托泊苷是通过抑制ERK通路发挥其抗增殖作用的,且其诱导的凋亡率可通过caspase抑制剂预处理得到部分逆转。经过依托泊苷处理后,内质网应激的标志性蛋白如CHOP,BIP,Caspase12,JNK的表达被激活,而JNK进一步激活促凋亡蛋白Bim和Bax,并同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的活性。应用JNK抑制剂后可以逆转依托泊苷抗增殖和促凋亡的作用。依托泊苷处理后减弱α-SMA和Type I collagen的表达水平,且增加了基质金属蛋白酶(MMPs)与其抑制剂(TIMPs)的比值。更重要的是,与正常肝细胞株相比,依托泊苷对肝星状细胞有更显著的抗增殖和促凋亡效果。结论:依托泊苷通过激活内质网应激从而诱导LX-2细胞的凋亡,并通过抑制胶原合成和促进胶原降解表现出抗纤维化的作用。因此,依托泊苷可成为治疗肝纤维化一个潜在药物靶点。
【学位授予单位】:南京大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R575.2

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