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《南京大学》 2017年
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TWEAK/Fn14通过激活NF-κB/STAT3信号通路诱导肝星状细胞分泌促炎症因子

王爱秀  
【摘要】:研究背景和目的肝纤维化(Liver fibrosis)以肝脏损伤后细胞外基质(extracellular matrix,ECM)大量沉积为特征,是大多数慢性肝脏损伤的最终结果。肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)是产生ECM的主要细胞,是肝纤维化的发生发展的关键细胞。既往研究表明,减少活化HSCs的数量是使肝纤维化逆转的主要因素。最近研究显示肿瘤坏死因子样弱凋亡因子(Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis,TWEAK)及其受体成纤维细胞生长因子诱导因子14(Fibroblast growth factor-inducible 14,Fnl4)在肝纤维化的调节过程中起重要的作用,但是目前关于TWEAK/Fnl4信号通路在HSCs中的作用及机制研究较少。因此,这篇研究我们主要揭示HSCs和TWEAK的关系,并探讨其中可能的机制。方法为了研究TWEAK/Fnl4在HSCs中的作用,我们用TWEAK或者小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)处理 LX-2 细胞,用酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和实时荧光定量 PCR(Real-time PCR,RT-PCR)法检测相关的促炎症因子的蛋白和mRNA表达水平;并用免疫印迹法(Western Blotting)或 RT-PCR 检测 Fnl4、核转录因子 kappaB(NuclearfactorkappaB,NF-κB)和信号转导子和转录激活子 3(Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)的表达,用western blot检测了细胞质和细胞核中总的和磷酸化NF-κB、STAT3的表达;然后用CCK-8检测LX-2细胞的存活率及Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率;另外我们还研究了微小RNA-19b(microRNA-19b,miR-19b)在TWEAK/Fn14信号通路中的作用。用TWEAK处理细胞后,用RT-PCR检测miR-19b的表达。用miR-19b模拟物(mimic)和抑制物(inbibitor)上/下调miR-19b的表达后,用western blot和RT-PCR检测Fnl4的表达;在LX-2细胞中共转染miR-19b mimic和构建的包含人Fnl4 3'非编码区(Untranslated region,UTR)结合的野生型和突变型质粒,用萤光素酶活性检测试剂盒检测荧光素酶活性。结果我们的研究发现,在LX-2细胞中Fnl4的上调对TWEAK具有时间及剂量的依赖性。TWEAK通过抑制miR-19b的表达而上调Fnl4的表达。TWEAK上调Fnl4后促进HSCs细胞因子的分泌,包括白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8),白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6),调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted,RANTES)和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1),这些促炎症因子的表达与 IκB/NF-κB(p65)和JAK2/STAT3信号通路活化密切相关,并且我们还发现了活化的p65和STAT3信号通路可以相互作用,共同促进炎症因子的分泌。结论总之,我们的研究表明在LX-2细胞中,我们发现miR-19b是Fnl4转录后的负调控因子,TWEAK通过下调miR-19b表达从而上调Fn14表达。TWEAK通过Fn14的表达激活NF-κB和STAT3信号通路,并且激活的p65和STAT3这两个信号通路之间可以相互作用,进而增加促炎性因子的分泌。本研究主要揭示了 TWEAK促进HSCs分泌促炎症因子的机制,这项研究可能为肝纤维化的预防和治疗提供新思路。
【学位授予单位】:南京大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R575.2

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