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《南京大学》 2017年
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RIP3介导的坏死性凋亡在牙周炎发病过程中的作用

柯晓菁  
【摘要】:[目的]Necroptosis是一种炎性的细胞死亡方式,可产生大量损伤相关分子型(damage-associatedmolecularpatterns,DAMPs)。它包含三个关键蛋白,受体相互作用蛋白激酶-1(receptor interacting protein kinase,RIP1),RIP3 及其底物混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase like,MLKL)。本实验的研究目的是探讨necroptosis是否影响牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)引起的炎症免疫应答和牙周炎的发病过程。[方法]在体外实验中,对THP-1细胞给予P.gingivalis刺激,Western Blot检测necroptosis的分子标记物-磷酸化MLKL的表达情况,确认necroptosis的发生;采用RIP1和MLKL的抑制剂Nec-1和NSA处理THP-1细胞,ELISA检测细胞在P.gingivalis刺激条件下分泌炎症因子水平的变化,LDH检测细胞死亡情况,分析necroptosis在应答P.gingivalis反应过程中的炎症作用:使用慢病毒干扰序列siRNA分别沉默RIP3和MLKL,进一步明确necroptosis影响单核细胞应答P.gingivalts的急性炎症反应。为进一步研究necroptosis在急性炎症中的作用,采用小鼠皮下小室模型,在小室内注射P.gingivalis造成急性感染,于不同时间点抽取小室渗出液,进行P.gingivalis培养和炎症因子检测,观察necroptosis对体内细胞清除P.gingivalis和释放炎症因子水平的影响。为进一步研究necroptosis在慢性炎症中的作用,在小鼠牙周炎模型实验中,用P.gingivalis提前浸泡过的丝线对小鼠双侧上颌第二磨牙进行结扎,1天后取出结扎丝线。每日给予NSA腹腔注射,隔天给予P.gingivalis龈沟内注射,持续2周,观察necroptosis对牙周炎发病过程的影响。[结果]THP-1细胞经P.gingivalis刺激8 h后检测到了磷酸化MLKL的表达。特异性抑制剂Nec-1和NSA均明显下调了 THP-1细胞分泌TNF-a和IL-6的水平;THP-1细胞使用NSA处理后,或者慢病毒siRNA沉默RIP3和MLKL后,P.gingivalis导致的细胞死亡显著减少。皮下小室感染1d后,NSA处理组的渗出液P.gingivalis的数量明显低于对照组。在1h和8h,NSA处理显著下调了小室渗出液中的TNF-α水平;而IL-6的表达在8h和1d也明显受到抑制。在小鼠牙周炎模型中,第二磨牙丝线结扎+龈沟内注射P.gingivalis引起明显的炎症性骨吸收,而NSA处理组的牙槽骨吸收量明显减少。并且,在P.gingivalis组的牙周组织中,磷酸化MLKL的免疫组化染色呈阳性。[结论]P.gingivalis可以激活THP-1细胞发生RIP3/MLKL介导的necroptosis,抑制necroptosis死亡通路能够有效减少P.gingivali 产生的细胞死亡,下调炎症因子分泌水平;在急性感染小室中阻断necroptosis可以减少炎症渗出水平,并有利于P.gingivalis清除;necroptosis参与了P.gingivalis诱导的牙周炎过程,阻断necroptosis可以减少P.gingivalis导致的炎症性牙槽骨吸收,延缓牙周炎进展。
【学位授予单位】:南京大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R781.42

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