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《南京大学》 2017年
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丹参酮Ⅰ调控Nrf2/ARE信号通路治疗放射性膀胱损伤的实验研究

张士伟  
【摘要】:放射性膀胱损伤(radiation-induced bladder injury,RIBI)是盆腔肿瘤放疗后常见的并发症。目前对于放射性膀胱损伤缺乏特异性的治疗手段。因此,探索放射性膀胱损伤的发生、发展机制以及相应的治疗手段有非常重要的临床意义。丹参酮-Ⅰ能够发挥舒张血管、清除氧自由基、稳定血管内皮功能等药理作用,对于脑卒中、心肌缺血、闭塞性动脉炎及动脉粥样硬化等心脑血管疾病具有良好的保护作用。NF-E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应原件(ARE)(Nrf2/ARE)信号通路作为目前抗氧化应激损伤方面研究最为热门的一种,其已被发现与众多疾病的发生、发展相关。已有研究认为丹参酮-Ⅰ与Nrf2/ARE信号通路在治疗肺氧化损伤方面具有显着疗效,但迄今为止还没有丹参酮-Ⅰ与Nrf2/ARE信号通路在放射性膀胱损伤中的关系的相关研究报道。本课题旨在研究丹参酮-Ⅰ通过激活Nrf2/ARE信号通路治疗氧化应激损伤在放射性膀胱损伤中的作用,为放射性膀胱损伤的治疗提供新的思路。本论文共分为三部分:第一部分:Nrf2/ARE信号通路在放射性膀胱损伤中的表达通过细胞模型及动物模型探索Nrf2/ARE信号通路在放射性膀胱损伤模型中的表达情况。以X-射线照射人输尿管尿路上皮细胞(sv-huc-1)及小鼠膀胱制造放射性膀胱损伤体外及体内模型。通过细胞活力测定、氧化应激指标及组织学指标评估模型建立情况。通过定量反转录聚合酶连锁反应(qPCR)、蛋白质印迹法(WB)等方法对Nrf2及其下游相关靶基因的表达情况进行检测。通过小干扰RNA(siRNA)技术沉默细胞中Nrf2的表达。研究发现X-射线能够诱导sv-huc-1细胞及膀胱损伤,且与X-射线的剂量相关。Nrf2/ARE信号通路在放射性膀胱损伤模型中的表达情况有所上调。沉默Nrf2基因表达后,Nrf2及其下游靶点表达量也显着降低,且能加重X-射线导致的放射性膀胱损伤。第一部分结果表明X-射线导致的放射性损伤能够激活机体自身Nrf2/ARE的表达,发挥自身抗氧化作用,可作为放射性膀胱损伤治疗的新靶点。第二部分:丹参酮-Ⅰ在放射性膀胱损伤模型中的保护性功能研究探索丹参酮-Ⅰ在放射性膀胱损伤模型当中的保护性作用。利用第一部分实验中的方法建立放射性膀胱损伤体外及体内模型。通过测定细胞活力及细胞凋亡情况评估丹参酮-Ⅰ对于放射性膀胱损伤体外模型的保护作用。通过组织学检测评估丹参酮-Ⅰ对于放射性膀胱损伤体内模型的保护作用。通过测定细胞及膀胱组织氧化应激指标评估氧化应激情况。结果表明丹参酮-Ⅰ可减少X-射线对细胞的损伤,流式凋亡检测结果进一步证实丹参酮-Ⅰ能够减少X-射线导致的细胞凋亡。DCFH-DA活性氧检测结果显示丹参酮-Ⅰ可显着减少X诱导产生的氧自由基(ROS)。体内实验结果表明:丹参酮-Ⅰ能够明显减轻X-射线导致的早期膀胱粘膜水肿情况。iNOS染色结果分析显示丹参酮-Ⅰ治疗能够减轻X-射线导致的早期膀胱粘膜炎症情况。丹参酮-Ⅰ能改善反射性膀胱损伤早期膀胱组织内氧化应激损伤情况。CD31免疫组化染色剂马松三色染色结果表明丹参酮-Ⅰ能够改善放射性膀胱损伤慢性期膀胱纤维化情况。丹参酮-Ⅰ在体、外条件下对放射性膀胱损伤均具有保护性作用,丹参酮-Ⅰ可能是通过调节氧化应激损伤来发挥其保护性作用的。第三部分:丹参酮-Ⅰ通过介导Nrf2/ARE信号通路治疗放射性膀胱损伤过程的氧化应激损伤探索Nrf2/ARE信号通路在丹参酮-Ⅰ治疗放射性膀胱损伤中的作用机制。利用前面实验方法建立放射性膀胱损伤体外及体内模型。通过qPCR及WB等方法测定各组细胞及膀胱组织中Nrf2/ARE信号通路的改变。通过siRNA技术沉默细胞中Nrf2基因表达,进而观察Nrf2基因沉默后丹参酮-Ⅰ对于放射性膀胱损伤体外模型的保护作用。通过基因敲除技术敲除动物Nrf2基因,并进一步观察Nrf2基因敲除后丹参酮-Ⅰ对于放射性膀胱损伤体内模型的保护作用。结果表明丹参酮-Ⅰ在体、内外条件下均可以显着增加Nrf2下游靶基因的表达。丹参酮-Ⅰ能够促进Nrf2由细胞质进入细胞核,进而激活下游通路。而Nrf2基因沉默表达以后,丹参酮-Ⅰ失去对放射性膀胱损伤体外模型的保护性作用,同样的,Nrf2基因敲除小鼠显示丹参酮-Ⅰ对放射性膀胱损伤的保护性作用减弱。丹参酮-Ⅰ可以通过介导Nrf2/ARE信号通路表达以达到治疗氧化应激应损伤在放射性膀胱损伤中目的。
【学位授予单位】:南京大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R730.55

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