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《南京大学》 2017年
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LncRNA MALAT1表达改变影响MSCs功能初探

李秀君  
【摘要】:子痫前期(PE)是妊娠期特发性多器官功能障碍性疾病,威胁母儿健康,是造成母胎死亡的主要原因之一。血管生成异常和免疫失衡被认为是PE发病的两大重要因素。间充质干细胞(MSCs)在调节血管生成和免疫平衡方面起着重要的作用。我们已有研究发现,PE患者脐带和蜕膜来源的MSCs呈现出增殖缓慢、细胞因子分泌异常、促血管生成能力差且免疫调节功能异常等特点。进一步,我们用正常产妇来源的MSCs治疗PE样小鼠模型后发现MSCs可以显著缓解小鼠的PE样症状,这说明MSCs在PE的发病过程中起着重要的作用。然而,调控MSCs生长和功能的具体分子机制尚不清楚。长链非编码RNA(1ncRNAs)是一类调控转录后基因表达的RNAs,可影响细胞的增殖、周期、凋亡和功能,在多种疾病中发挥着重要的作用。研究发现,1ncRNAs在PE患者胎盘中的表达也发生了变化。MALAT1(Metastasis-Associated Lung Adenocarcinoma Transcript 1),又名 NEAT2(Nuclear-Enriched Abundant Transcript 2),被认为是肺癌转移的标志。研究发现,PE患者胎盘组织中MALAT1表达降低,且MALAT1与PE患者滋养细胞的增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭有关。然而,MALAT1在MSCs中的作用尚无报道。我们前期实验结果显示,PE患者胎盘组织和蜕膜来源MSCs中MALAT1的表达明显低于正常产妇。随后,我们通过体外实验,初步探索了 lncRNAMALAT1对MSCs细胞特性、增殖和功能的影响,以揭示PE患者MSCs增殖和功能发生异常的可能的分子机制。1、改变MALAT1表达不影响MSCs的表型和分化功能在前期实验中,我们发现,PE患者胎盘组织和蜕膜MSCs中,MALAT1表达降低,但是MALAT1表达降低的影响尚不清楚。利用瞬时转染的方法,我们在正常产妇来源的MSCs中分别过表达MALAT1和干扰MALAT1后,发现改变MALAT1的表达对MSCs细胞表型及分化功能无明显影响。2、MALAT1通过VEGF促进MSCs的增殖、迁移、侵袭和调节血管形成能力利用瞬时转染的方法,我们构建了低表达和过表达MALAT1的MSCs。CCK-8、细胞周期和凋亡实验发现,过表达MALAT1后,MSCs的增殖明显增加,凋亡比例降低。随后我们又通过细胞划痕实验、transwell实验和HUVEC血管生成实验,比较了 MALAT1表达改变对MSCs功能的影响。结果显示:MALAT1过表达后,MSCs不仅自身迁移能力增加,其培养上清也显著促进滋养细胞HTR-8/SVneo的迁移、侵袭和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的血管生成。而MALAT1表达被敲除后,MSCs的增殖、迁移及功能均低于正常对照,且凋亡比例增加。通过靶基因筛选及Q-PCR验证,我们发现VEGF的表达在PE患者脐带组织和MSCs中,均明显降低,且VEGF与MALAT1的表达正相关。细胞实验进一步证实,MALAT1促进MSCs中VEGF的表达,而干扰MALAT1后VEGF也随之降低。双荧光素酶报告实验进一步确认MALAT1与VEGF之间存在靶向关系。当用VEGF中和抗体处理过表达MALAT1的MSCs培养上清后,MSCs细胞生长、迁移、侵袭和调节血管生成能力显著下降。这些结果表明MALAT1是通过调控VEGF的表达来影响MSCs的增殖和功能。3、MALAT1增强MSCs的免疫调控作用。我们改变MSCs中MALAT1表达后,收取其培养上清用于与THP-1诱导的巨噬细胞共培,以检测巨噬细胞分型的变化,来探究MALAT1是否影响MSCs的免疫调节功能。结果显示MALAT1过表达的MSCs上清可促进巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化,而MALAT1敲减后,MSCs上清抑制巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化。随后我们通过检测MALAT1转染MSCs后,IL-6、COX-2、IDO等细胞因子的表达发现,MALAT1可以促进MSCs中IDO的表达。IDO是促进巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化的重要因子。4、氧化应激降低MALAT1的表达实验发现,PE患者来源MSCs中,MALAT1的表达明显降低且其对MSCs的增殖、迁移、侵袭、血管生成和免疫调控都有重要的影响,但其降低的诱因尚不清楚。炎症和过度氧化应激被认为是引起PE的两大重要因素,因此,我们用LPS、IL-6、TGF-β1和不同浓度的H202分别刺激正常产妇来源的MSCs并检测MALAT1的表达。结果表明,H2O2刺激后可降低MSCs中MALAT1的表达,而LPS、IL-6、TGF-β1对MALAT1的表达没有影响。综上所述,我们发现MALAT1促进MSCs的增殖并影响其对血管生成、滋养细胞侵袭及免疫调控等作用。即:MALAT1通过诱导MSCs中VEGF的生成,促进MSCs增殖、迁移、侵袭和血管生成调控;MALAT1通过诱导MSCs中IDO的生成,促进M2型巨噬细胞的转化,增强MSCs的免疫调控作用。结论:MALAT1异常表达可影响MSCs的增殖和功能。
【学位授予单位】:南京大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R714.244

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