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《南京大学》 2017年
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Wnt信号通路调控外胚层发育不全患者颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化的初步研究

鲍东昱  
【摘要】:[研究背景及意义]外胚层发育不全是一类遗传性疾病,临床表现多样,涉及突变基因多达77个,在口腔的表现主要为牙齿畸形、牙列缺损或缺失、唾液腺分泌缺少或缺失以及颌骨萎缩,目前无根治方法。我们希望通过间充质干细胞相关的组织再生方法,从而恢复患者的骨量,并且在这一过程中,探究患者颌骨发育不足的机制,尝试从根本上解决问题。间充质干细胞为一类来源于胚胎发育早期的中胚层及外胚层的一类重要细胞,为多能干细胞,能够分化形成各种细胞,并在组织及器官的损伤修复中起到较为关键的作用。因其来部分来源于外胚层,且在骨生长的过程中具有重要的作用,因此是研究外胚层发育不良患者颌骨发育不足的有代表性的细胞。外胚层发育不全患者常伴有TP63基因或EDA/EDAR/EDARADD基因的突变,其发病与各种信号通路有着密切的关系,其中,Wnt通路调控胚胎发育早期阶段的细胞增殖与分化,与间充质干细胞的增殖分化关系密切,同时又能够与TP63以及EDA/EDAR/EDARADD等相互作用,是该病发病过程中较为重要的信号通路。因此,对于Wnt信号通路在外胚层发育不全患者间充质干细胞增殖分化相关的研究,或许能够揭示该疾病的部分发病机制,从而找到一些潜在的治疗方案,也能够通过调控间充质干细胞的成骨分化从而恢复患者的颌骨骨量,以利于种植修复。[目的]体外实验探究胚胎发育阶段中外胚层发育不全疾病的发病过程中Wnt通路的作用机制,寻求可能的治疗方案,提高患者自体间充质干细胞的成骨能力。[方法]从外胚层发育不全患者以及全身情况正常的种植科患者的颌骨内获取颌骨骨髓间充质干细胞,于体外培养并进行鉴定。通过流式细胞术鉴定细胞表面特异性抗原的表达。之后,CCK-8细胞增殖实验比较外胚层发育不全患者与正常组的间充质干细胞增殖速度的差异,以比较两者细胞增殖能力的区别。克隆形成实验比较两组细胞克隆形成能力的区别,以比较两组细胞的活性。从上述研究比较两组间充干细胞的性质后,我们对其在Wnt信号通路调控下的成骨能力进行了对比。首先将细胞通过Wnt信号通路的激动剂CHIR-99021以及抑制剂XAV-939在成骨环境下对细胞进行刺激,为期2-4周。2周后,通过Western Blot检测成骨相关蛋白RUNX2的表达以及通过PCR检测RUNX2基因表达;4周后茜素红染色,比较两组细胞生成钙结节的数量及大小,从而比较两组细胞的成骨能力差异。[结果]外胚层发育不全患者以及正常患者的颌骨骨髓间充质干细胞被成功分离并体外培养,传代后仍具有较好稳定性。流式细胞术结果显示,两组细胞的CD73及CD90均呈高表达,而CD34及CD45低表达,证明两组细胞都具有间充质干细胞表面的特异性抗原,并且排除了造血干细胞。CCK-8细胞增殖实验结果显示,正常组的细胞增殖速度明显高于外胚层发育不全组,可能是患者颌骨发育不足的原因之一。在克隆形成实验中,两者都能正常形成细胞克隆,且数量上无明显差异,可以认为两组细胞活性无明显差异。在Wnt信号通路的调控下,对于正常组的间充质干细胞来说,通过CHIR-99021处理后,钙结节的数量及大小相对于单纯的成骨组明显增多,而通过XAV-939处理后,钙结节数量及大小相对于单纯的成骨组则明显减少。对于外胚层发育不全组的细胞,成骨组可见明显的红染结节。CHIR-99021处理后,钙结节数量较单纯成骨组明显减少,而通过XAV-939处理后,钙结节数量及大小相对于单纯成骨组明显增加,Western及PCR结果与此趋势基本一致。[结论]外胚层发育不全患者与正常人的颌骨骨髓间充质干细胞,在克隆形成能力、间充质干细胞表面特异性抗原表达以及体外成骨能力上,未见显著差异。而其颌骨骨髓间充质干细胞体外增殖相对较慢,可能是患者颌骨发育不良的形成因素之一。Wnt信号通路激动剂CHIR-99021以及抑制剂XAV-939在调控正常人与外胚层发育不全患者的间充质干细胞成骨过程中起到了不同的作用。在XAV-939的作用下,外胚层发育不全患者的JBMMSCs的体外成骨能力增强。
【学位授予单位】:南京大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R782.2

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