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《南京大学》 2018年
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CARD9通过影响MDSCs募集及功能调控肺癌进程的机制研究

徐倩芸  
【摘要】:胱天蛋白酶募集域蛋白9(CARD9)是细胞中重要的信号转导的连接蛋白,CARD9分子在髓系细胞处于高表达的状态。在结肠癌肝转移(SL4)的模型中,研究发现CARD9分子参与了肿瘤内巨噬细胞的极化过程,M2型巨噬在小鼠体内发挥了促炎的作用,恶化了癌症的发生发展;然而CARD9在肺癌发生发展中的作用仍然是未知的。本论文在野生鼠(wild-type,WT)和CARD9基因敲除(CARD9~(-/-))鼠中建立了路易斯肺癌(LLC)小鼠模型,结果发现CARD9~(-/-)鼠比WT鼠肿瘤体积显著增大,恶性程度显著增高。我们发现在CARD9~(-/-)鼠肿瘤组织中髓系来源的免疫抑制细胞(MDSCs)显著积聚,而细胞毒性T(CD8+T)细胞则明显少于WT荷瘤小鼠。在腹腔注射anti-Gr-1消除MDSCs后则能有效缓解CARD9~(-/-)鼠的肿瘤恶性程度。体外实验研究发现在肺癌细胞上清液的刺激下CARD9~(-/-)鼠来源的MDSCs中非经典NF-κB通路活化程度较WT鼠来源的MDSCs显著增强,下游产物吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)表达上调,MDSCs的免疫抑制功能也明显增强。当干扰非经典NF-κB通路后,CARD9~(-/-)鼠来源的MDSCs下游产物IDO表达显著下调。综上所述,我们发现了 CARD9可通过NF-κB通路调控MDSCs分泌IDO,进而参与肺癌的发生发展。1.CARD9影响路易斯肺癌的发展且与MDSCs有关CARD9作为一个重要的衔接蛋白,在许多疾病模型中发挥重要作用。某些真菌、细菌和病毒都能够通过活化CARD9信号通路调控固有免疫,并影响机体获得性免疫过程。已有研究发现在肝转移的结肠癌模型中CARD9能够影响巨噬细胞的极化过程,促使Ⅰ型巨噬细胞向Ⅱ型转变。在针对真菌感染的模型研究中发现,小鼠脾脏中的MDSCs表面上的模式识别受体会与真菌的β-葡聚糖结构相偶联,从而活化下游的BCM信号复合物,传递相应的胞内信号,接着活化下游的NF-κB信号通路,促进IL-1β的表达上调,促进了 MDSCs的大量积聚,干扰了体内的Th-1和Th-17免疫反应。由此我们推测在肿瘤模型中CARD9信号分子可能会和MDSCs的免疫调节相关。为了研究CARD9与肺癌进程的关系,我们在CARD9~(-/-)鼠和野生鼠上建立路易斯肺癌(lewis lung cancer,LLC)模型。实验结果发现与野生鼠相比,CARD9~(-/-)鼠肿瘤体积显著增大,肿瘤恶性程度较重。流式细胞检测发现CARD9~(-/-)鼠肿瘤组织中MDSCs显著增多,而细胞毒性T细胞(CD8+Tcells)显著减少。在腹腔注射anti-Gr-1抗体消除MDSCs后,CARD9~(-/-)鼠的肿瘤体积及恶性程度得到明显缓解。2.CARD9通过非经典NF-κB通路调控MDSCs分泌IDO我们进一步研究了 CARD9影响MDSCs功能的分子机制。实验选取CARD9~(-/-)鼠和WT鼠大腿股骨和胫骨骨髓来源的原代MDSC,外源性给予LLC细胞培养上清刺激一定时间,结果发现与WT小鼠来源的MDSCs相比,CARD9~(-/-)鼠来源的MDSCs的非经典NF-κB通路显著活化,表现为NIK、P-P100、RelB、P52表达上调,下游产物IDO表达量也大幅上调。T细胞增殖实验进一步揭示了CARD9~(-/-)鼠来源的MDSCs对T细胞增殖的抑制作用更加明显,其免疫抑制作用更强。未经LLC细胞培养上清刺激的CARD9~(-/-)鼠和WT鼠来源的MDSCs的免疫抑制作用则无明显差异。因此,我们发现CARD9通过非经典NF-κB通路调控MDSCs分泌IDO,影响MDSCs的免疫抑制功能,从而参与肺癌的发生发展。3.人肺癌样本中CARD9与MDSCs功能相关基因表达呈负相关为了进一步明确CADR9与MDSCs在人肺癌中存在的关系,我们收集了 48例肺癌患者的组织标本,检测了其中CARD9的表达水平和MDSCs功能相关基因的表达水平。实验结果分析发现CARD9在肿瘤组织,特别是癌旁组织中显著高表达,并且CARD9的表达与MDSCs的功能基因的表达呈负相关性,实验结果与模型鼠中的结果一致。
【学位授予单位】:南京大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R734.2

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