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《苏州大学》 2010年
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致弱日本血吸虫尾蚴诱导小鼠免疫保护机制研究

周霞  
【摘要】:血吸虫病是世界上威胁着约2亿人口健康的一大重要寄生虫病。尽管化疗在我国实施过程中起到了很好作用,却面临着再感染及抗药性等问题。研制发展血吸虫病疫苗是理想的防治方法。随着分子生物学技术的发展与应用,有关血吸虫病疫苗候选抗原的研究有了重大进展,其中WHO所挑选的六种抗原即Sm97、GST、rIrVs、Sm23、TPI和Sm14已在指定独立实验室的深入研究发现这6种最具希望的血吸虫候选抗原分子,在小鼠均不能稳定获得40%以上的保护力,因而这些抗原可能并不是合适的疫苗分子。 血吸虫病疫苗发展的另一条替代途径和策略是诱导自然感染状态下并不正常出现的免疫应答,以期产生高水平的保护力。研究表明,致弱血吸虫尾蚴疫苗是所有用于研究血吸虫疫苗中保护力最强的,而致弱尾蚴是在入侵早期即局部皮肤、皮肤淋巴结和肺部引起免疫应答强有力的刺激因子并诱导了保护性免疫。一般认为,在血吸虫感染人体的整个过程中,宿主免疫应答发展至少经历3个变化的时相,于感染后最初的3~5周,宿主暴露在移行中的未成熟童虫刺激中,呈现Th1优势应答,至第5~6周,当成虫开始产卵时,Th1应答降低,并呈现Th2优势应答,在随后感染进入慢性期,Th2应答受到明显调节;辐照致弱尾蚴进入体内后,不能发育为成虫并产卵,在此过程中,致弱尾蚴虫体的形态结构、发育、生物学行为(移行速度)以及抗原成分与正常尾蚴相比,均发生明显的改变:尾蚴口腹吸盘肿胀;体部收缩;尾端呈皱褶状变化;神经肌肉的协调性破坏,在皮下滞留的时间延长,其体内的移行被“截”短,一部分停留在皮肤,其余的最远可移行至肺。致弱尾蚴在移行至主要免疫系统之前,例如脾、胸腺等前需要在体内移行一段距离,其保护性反应主要从皮肤、引流淋巴结到肺引起的各种效应反应的综合结果,这三个部位引起的多方面免疫反应,包括从Th1有关的细胞调节活动到Th2涉及的抗体应答对保护力至关重要。加大辐照剂量后致使仅局限皮肤期移行的致弱尾蚴并不能有效的诱导免疫保护作用,故致弱童虫在肺期的移行对诱导有效的免疫效显得更为重要。最近研究比较UV辐照致弱曼氏血吸虫尾蚴与Sm23(曼氏血吸虫膜蛋白)诱导小鼠(C57BL/6)产生的保护力及其免疫应答的异同,两组的保护力分别为60%和45%,明显的不同出现在肺期炎症应答,致弱尾蚴免疫组肺期炎症反应明显,单核细胞聚集在炎症灶附近,并与移行的童虫相关。以上结果亦显示,肺可能是产生高保护性免疫应答的重要部位。 树突状细胞(Dentric cell, DC)是目前已知的功能最强的抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC),在先天性、获得性免疫间起着较好的桥梁作用。CD11c分子是分子量150kD的αX亚单位β2整合素家族成员,是目前被广泛应用的树突状细胞的特异性标记物,也是是DC成熟重要的表面标记之一,其表达强度能部分代表局部组织中DC的聚集。T细胞是免疫应答的中心环节,针对非己物质的排异反应强度主要由其所引发的机体免疫系统激活程度决定。T细胞活化程度是判别机体免疫功能状态的重要指标。CD25分子量gp55kD,又名IL-2Rα,组成高亲和力IL-2受体,促进T细胞的生长,是活化T细胞表达的重要标志性分子,检测该分子表达则可反映T细胞活化情况[7]。本研究在建立紫外线辐照致弱日本血吸虫尾蚴免疫BALB/c小鼠模型基础上,着眼于免疫小鼠早期免疫应答阶段——致弱尾蚴感染小鼠后在肺部滞留引起的免疫病理改变及其诱导可能免疫保护机制研究,对脾、肺组织细胞树突状细胞表面分子CD11c的表达与T细胞激活程度等应答特征分析,研究对致弱尾蚴免疫小鼠模型中起决定性作用的肺期童虫诱导的肺组织免疫病理反应及其所诱导的T细胞在脾等免疫器官与外周血中免疫应答特征。此外,本实验延长观察时间到致弱尾蚴免疫小鼠攻击感染6~8w后肝肉芽肿形成期CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞在正常感染小鼠和免疫后攻击感染小鼠中表达差异,分析其诱导的免疫应答特征及其可能机制,从而对目前公认可诱导最高免疫保护作用疫苗——辐照致弱尾蚴诱导免疫应答规律,为血吸虫病防治提供借鉴。 第一部分紫外线致弱日本血吸虫尾蚴诱导BALB /c小鼠免疫保护作用研究 【目的】建立紫外线(UV)致弱日本血吸虫尾蚴免疫BALB/c小鼠动物模型,测定BALB/c小鼠作为辐照致弱日本血吸虫尾蚴免疫模型的免疫保护力。 【方法】经腹部皮肤用UV辐照致弱日本血吸虫尾蚴连续三次免疫BALB/c小鼠,每次间隔4周,末次免疫后3周用正常尾蚴进行攻击感染,同时设正常感染对照组。攻击感染6周后解剖小鼠,计算减虫率、减卵率,并观察虫体发育情况和肝组织肉芽肿及其细胞免疫应答情况。 【结果】免疫组的减虫率和减卵率分别为37.90 %和51.16 %;免疫组小鼠体内虫体发育明显滞后于正常感染对照组内虫体;免疫组小鼠肝脏虫卵肉芽肿较正常组明显减少。 【结论】UV致弱日本血吸虫尾蚴多次经皮肤免疫BALB/c小鼠能诱导较高的免疫保护力,免疫组与正常感染组相比减虫率和减卵率分别为37.90 %和51.16 %,BALB/c小鼠可作为致弱日本血吸虫尾蚴免疫小动物模型,而其免疫保护机制有待进一步研究。 第二部分紫外线致弱日本血吸虫尾蚴感染小鼠引起的肺组织细胞反应及虫体扫描电镜观察 【目的】通过观察紫外线(Ultraviolet,UV)辐照致弱日本血吸虫( Schistosoma japonicum , Sj )尾蚴感染小鼠后皮肤、肺组织细胞反应以及肺期虫体的受损情况,探寻辐照致弱日本血吸虫尾蚴在小鼠体内诱导免疫病理反应和Sj受损情况。 【方法】扫描电镜观察UV致弱日本血吸虫尾蚴与正常尾蚴并以UV致弱S j尾蚴经腹部皮肤感染小鼠4、7、14和21天后剖杀,分别取肺组织固定、切片,光镜下观察虫体周围的组织细胞反应,并与同时期的感染小鼠组织切片进行比较,同时对小鼠体内肺期Sj童虫进行扫描电镜观察。 【结果】扫描电镜观察辐照致弱尾蚴与正常尾蚴相比虫体略有收缩,存在口腹吸盘肿胀现象,尾叉部分卷曲;辐照致弱尾蚴感染后4~7天,小鼠肺期童虫虫体周围出现较明显的出血灶和炎症反应,并有一定量的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞的浸润,同时期的正常感染小鼠组织内虫体周围炎症反应却不明显;虫体体壁可见不同程度的损伤,电镜观察显示小鼠体内的肺期童虫存在明显的畸形和发育延迟。 【结论】扫描电镜观察发现紫外线辐照致弱尾蚴与正常尾蚴形态略有差异,将此两组尾蚴分别感染小鼠后致弱组肺期童虫在小鼠体内不能正常发育成熟,紫外线减毒尾蚴发育而来的致弱肺期童虫变化可能与减毒尾蚴诱导宿主免疫反应有关而并非完全是辐照的直接损伤;致弱尾蚴在肺期滞留时间较长,引起的病理损害主要表现为在肺部弥漫性出血灶、炎症细胞浸润、嗜酸性脓肿形成等肺期病理改变,肺部的病理改变的可能与该致弱尾蚴免疫小鼠诱导高免疫保护作用机制有关。 第三部分紫外线致弱致弱日本血吸虫尾蚴免疫BALB/c小鼠血清IgG水平动态及其被动转移保护力研究 【目的】动态观察致弱尾蚴免疫BALB/c小鼠血清中的IgG抗体水平及其被动转移至同种小鼠后攻击感染后可获得的免疫保护力,检测辐照致弱尾蚴多次免疫接种后是否可以诱导体液免疫及其免疫保护作用。 【方法】采用用紫外线减毒日本血吸虫尾蚴免疫3次,免疫间隔4周免疫BALB/c小鼠,末次免疫后每周收集小鼠血清至第10周并动态观察致弱尾蚴免疫组BALB/c小鼠血清中的IgG抗体水平并将此在不同时间点收集血清被动转移至另一组BALB/c小鼠体内,观察被动免疫小鼠减虫率和减卵率以评价被动免疫保护作用。 【结果】结果显示辐照致弱尾蚴免疫组小鼠第6周时IgG抗体水平达到峰值且明显高于同期的正常感染组;致弱日本血吸虫尾蚴免疫小鼠血清在攻击感染前被动转移可激起小鼠较高的免疫保护力(55%)。 【结论】辐照致弱尾蚴多次免疫接种BALB/c小鼠血清被动转移同种小鼠可诱导较高的免疫保护作用,提示体液免疫在辐照致弱日本血吸虫尾蚴诱导免疫保护机制中发挥了一定作用。 第四部分紫外线致弱日本血吸虫尾蚴诱导BALB/ c小鼠早期免疫应答动态变化的研究 【目的】观察紫外线辐照致弱日本血吸虫尾蚴免疫BALB/c小鼠与正常尾蚴直接攻击正常BALB/c小鼠后,在感染早期(7、14、21天)小鼠脾、肺组织中树突状细胞和T细胞等免疫细胞应答动态变化,探讨致弱尾蚴免疫小鼠早期应答特征。 【方法】清洁级10~12周龄BALB/c雌性小鼠56只,除8只作为0组不加感染/免疫外,其余平均分为2组,每组24只,分别用辐照致弱尾蚴免疫和正常尾蚴感染,感染/免疫后第7、14、21天分别剖杀小鼠,比较辐照致弱尾蚴免疫小鼠与正常感染小鼠早期脾组织中CD3~+CD25~+/CD3~+T比率分析T细胞免疫活化程度及其动态变化;结合免疫组化方法检测以上各感染点脾组织、肺组织中树突状细胞表面分子CD11c、T细胞表面分子CD25表达差异。 【结果】正常尾蚴感染的小鼠肺组织炎症反应在第7天达到高峰后逐渐下降,第21天基本恢复,而辐照致弱尾蚴免疫组小鼠肺组织在第14天炎症反应才达到高峰,第21天反应仍十分强烈。紫外线辐照致弱尾蚴免疫小鼠较正常感染小鼠在攻击感染后第7、14、21天能在肺组织募集更多的CD1lc~+DC,使得血吸虫抗原在感染早期就能得到更有效的提呈和处理,这可能是致弱尾蚴能诱导高免疫保护力的原因之一;流式结果表明,脾细胞的中CD3~+CD25~+/CD3~+T比率在感染后7天正常感染对照组明显与致弱尾蚴免疫组无明显差异,在第14、21天,致弱童虫移行到肺部时期,T细胞才明显激活,CD3~+CD25~+/CD3~+T比率明显高于正常感染对照组。 【结论】辐照致弱尾蚴免疫小鼠和正常感染小鼠肺部病理改变存在明显差异,正常感染组肺部病理改变表现为一过性出血现象,炎症反应较弱;致弱尾蚴免疫组小鼠肺期病理反应强,持续时间长,至感染后21天,肺部可见嗜酸性脓肿形成,出血灶仍然可见。在攻击感染后7、14、21天,致弱尾蚴免疫组肺部代表树突状细胞分化成熟分子CD11c阳性细胞均高于正常感染对照组,提示致弱尾蚴在肺部可募集更多抗原递呈细胞并使之活化,在感染后14、21天致弱尾蚴组代表T细胞激活程度的CD3~+CD25~+/CD3~+T比率亦高于正常感染对照组,在辐照致弱尾蚴免疫小鼠模型中对再次攻击感染的日本血吸虫“拦截”作用主要发生在肺期,在日本血吸虫杀伤过程中,致弱尾蚴免疫组小鼠肺期树突状细胞和T细胞活化程度明显高于正常感染对照组,对虫体的清除起关键作用。 第五部分Treg细胞在紫外线致弱日本血吸虫尾蚴免疫BALB/c小鼠体内的表达变化研究 【目的】探讨紫外线致弱日本血吸虫尾蚴免疫BALB/c小鼠与正常感染小鼠在攻击感染后6周、8周小鼠外周血及肝脾组织内CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞的分布和数量变化及其意义。 【方法】采用免疫组化染色观察紫外线辐照致弱尾蚴免疫小鼠攻击感染和正常感染小鼠后6周、8周小鼠肝、脾组织Foxp3的表达,同时采用流式细胞技术检测以上两组小鼠脾细胞与外周血中CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞在CD4~+CD25~+T细胞中的比率。 【结果】致弱尾蚴免疫小鼠攻击感染和正常感染小鼠后6周、8周后免疫组小鼠肝、脾组织Foxp3的表达高于正常感染对照组,具有显著性差异,P 0. 05 ,免疫攻击感染组小鼠脾细胞与外周血中CD4~+CD25~+ Foxp3~+细胞占CD4~+ CD25~+细胞比例明显高于正常感染对照组,差异具显著性,P 0. 05。 【结论】紫外线辐照致弱免疫攻击感染组小鼠脾细胞与外周血中CD4~+CD25~+ Foxp3~+Treg细胞比率高于正常感染对照组,其可能的机制为紫外线辐照作用有可能破坏了正常血吸虫分泌一些抑制因子的功能,从而使免疫应答处于比较稳定的状态,并没有受到血吸虫分泌因子的调节,进一步研究辐照致弱尾蚴免疫小鼠体内Treg细胞数量和功能的变化有助于了解辐照致弱尾蚴诱导的免疫保护机制。 综上所述,本论文获得了以下研究结果: 紫外线辐照致弱日本血吸虫尾蚴在BALB/c小鼠主要在皮肤与肺部被清除,并以肺期“拦截”为主,肺部移行阶段致弱童虫可诱导较强的免疫细胞反应;紫外线减毒尾蚴发育而来的致弱肺期童虫变化可能与减毒尾蚴诱导宿主免疫反应有关,而并非完全是辐照的直接损伤。 辐照致弱尾蚴免疫小鼠经正常尾蚴攻击感染可诱导较高的免疫保护作用;经辐照致弱尾蚴多次免疫小鼠血清经被动转移小鼠可诱导较高免疫保护作用,提示在紫外线辐照致弱尾蚴诱导的免疫保护作用机制中体液免疫也参与了免疫保护作用。 正常尾蚴攻击感染辐照致弱免疫小鼠,感染早期小鼠肺、脾组织可诱导更多树突状细胞的活化,从而介导了后期的T淋巴细胞激活;延长观察时间至感染后6周、8周,免疫组小鼠肝、脾组织CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞亦高于正常感染对照组,其可能的机制为紫外线辐照致弱尾蚴诱导免疫干扰或破坏了血吸虫分泌一些抑制因子的功能,从而使免疫应答处于比较稳定的状态,并没有受到血吸虫分泌因子的调节,以上免疫特征与辐照致弱尾蚴诱导较高免疫保护作用机制关系还有待进一步研究。
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R392

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中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王婷;日本血吸虫尾蚴“延迟脱尾”现象及其临床意义研究[D];华中科技大学;2013年
2 田芳;致弱日本血吸虫尾蚴诱导猪产生高保护力效应的免疫应答事件的研究[D];南京医科大学;2010年
3 蔡鹏飞;日本血吸虫多表位疫苗构建探索和TSP-2抗原鉴定[D];中国协和医科大学;2008年
4 周霞;致弱日本血吸虫尾蚴诱导小鼠免疫保护机制研究[D];苏州大学;2010年
5 牛丽文;瘦素在日本血吸虫病肝纤维化中的作用及分子机制的实验研究[D];华中科技大学;2007年
6 吴艳艳;芦荟大黄素和吡喹酮对小鼠日本血吸虫病肝纤维化模型的影响[D];华中科技大学;2009年
7 何卓;日本血吸虫未成熟卵单链抗体库的构建、筛选及在疫苗研究中的应用[D];中南大学;2008年
8 张永;柔肝抑纤饮对血吸虫病小鼠早期肝纤维化形成的干预作用及加用二至丸后的对比研究[D];山东中医药大学;2006年
9 宋晓蓉;日本血吸虫感染诱导的Th免疫偏移对小鼠胶原性关节炎的影响[D];安徽医科大学;2011年
10 陈柏林;骨桥蛋白在日本血吸虫感染小鼠肝脏中的表达及其中和抗体对肝脏病理改变的影响[D];中南大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王素蓉;日本血吸虫尾蚴逸出节律性及尾蚴趋向吸附的研究[D];苏州大学;2014年
2 王本敬;Real-time PCR检测水体日本血吸虫尾蚴和小鼠感染早期检测的研究[D];苏州大学;2011年
3 吴勇权;荧光成像技术对部分抗血吸虫药物与日本血吸虫尾蚴的作用机理研究[D];赣南师范学院;2010年
4 章登吉;日本血吸虫重组多价疫苗的研制与免疫保护功能评估[D];上海师范大学;2006年
5 孙安国;日本血吸虫期别、性别差异表达蛋白质组研究[D];中国农业科学院;2006年
6 袁鑫;日本血吸虫铁蛋白基因的克隆及其在油菜中的表达和活性检测[D];湖南农业大学;2007年
7 郝知友;日本血吸虫SjIR3基因核酸疫苗的研究[D];湖南农业大学;2007年
8 彭先楚;日本血吸虫18kDa天然分子抗原及其候选基因疫苗的研究[D];中南大学;2006年
9 陆正贤;聚合酶链反应在日本血吸虫病家兔感染早期检测及疗效考核中的应用研究[D];苏州大学;2007年
10 王培;扶正化瘀胶囊对鼠血吸虫肝纤维化的治疗作用及机制探讨[D];南华大学;2012年
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