收藏本站
《苏州大学》 2010年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

针对PTN重组慢病毒介导的siRNA技术在小细胞肺癌基因治疗中的实验研究

余勇  
【摘要】:目的构建针对多效蛋白(pleiotrophin,PTN)基因的小干涉RNA(siRNA)慢病毒表达载体并观察其对人小细胞肺癌H446细胞株PTN表达抑制及对细胞生长及凋亡的影响。同时观察PTN基因沉默后,人小细胞肺癌H446细胞中与血管新生、肿瘤生长、侵袭过程相关的血管内皮细胞生长因子(VEGF)、angiomotin(Amot)、schlafen5(Slfn5)和金属蛋白酶9(MMP-9)4种基因的表达变化。构建人小细胞肺癌H446细胞裸鼠异种移植瘤模型,观察PTN基因RNA干扰病毒对移植瘤瘤体生长的抑制作用。 方法利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测PTN在H446细胞中的表达。设计四对针对PTN基因的小发夹RNA(shRNA)序列,与Plvthm载体连接,构建慢病毒表达载体LV(lentiviral)-shPTN,连接产物转化到DH5α感受态细胞,阳性克隆测序鉴定。再用LV-shPTN与pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G三种质粒共转染293T细胞,小量包装与纯化产生慢病毒颗粒。病毒感染H446细胞后,用荧光定量PCR及Western blotting检测细胞中PTN基因的表达。选择对PTN基因干扰效率最高的候选慢病毒载体进行大量包装、纯化及病毒滴度测定。将获得的病毒感染H446细胞,实验分为正常未干扰细胞组、感染空对照病毒的阴性对照组、感染PTN基因RNA干扰病毒抑制组、化疗组及感染PTN基因RNA干扰病毒抑制加化疗组。采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞生长,流式细胞仪(FCM)分析细胞凋亡。RT-PCR检测未干扰细胞组、阴性对照组、PTN抑制组和PTN抑制加化疗组细胞中Amot、Slfn5、MMP-9和VEGF的表达。采用H446细胞直接皮下接种的方法构建人小细胞肺癌H446细胞裸鼠异种移植瘤动物模型,分为正常未干扰组,化疗(顺铂)组,干扰PTN的病毒组,化疗+干扰PTN的病毒组和阴性病毒对照组。瘤体附近多点皮下注射病毒或顺铂后,分别于第1、2、7、15天测量瘤体体积。并在治疗第15天分别用RT-PCR和Western blot方法检测正常未干扰组、阴性病毒对照组及干扰PTN的病毒组中PTN的表达。 结果RT-PCR和Western blot检测结果均表明,PTN基因在H446细胞中表达显著高于H460细胞。构建的慢病毒载体经测序验证正确。所构建的shRNA序列(GCAGCTGTGGATACTGCTGAA)对PTN mRNA的抑制效率为72%,对PTN蛋白的抑制效率为59.2%。大量包装与纯化后病毒滴度为1×108 TU/ml。PTN基因抑制组的H446细胞活力显著低于正常未干扰组和阴性对照组细胞,基因抑制联合化疗组较单纯基因抑制组及化疗组细胞活力下降,细胞凋亡率增高,并具呈浓度依赖性。PTN基因沉默后,H446细胞中Slfn5和MMP-9的表达分别较阴性对照组上调了165.1%和47.3%,而Amot和VEGF的表达分别较阴性对照组下调了33.1%和26.6%。协同化疗后,上述趋势更为明显。动物实验瘤体组织中干扰PTN病毒组PTN mRNA和PTN蛋白的表达明显低于正常未干扰组及阴性病毒对照组,抑制率为分别为39%及28%。干扰PTN病毒组瘤体体积显著小于正常未干扰组及阴性病毒对照组,若协同化疗则瘤体缩小更明显。 结论构建PTN RNA干涉载体,转染后可有效降低H446细胞PTN的转录和表达,抑制H446细胞的生长并促进其凋亡,并可进一步影响H446细胞增殖和转移相关基因的表达变化。动物实验也显示针对PTN基因靶向治疗可显著抑制移植肿瘤在体内的生长,若与化疗协同则抑制作用更强。有望为小细胞肺癌基因治疗提供一种选择的治疗手段。
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R734.2

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前7条
1 胡迎春;刘敏丽;李刚;霍艳英;吴德昌;;siRNA沉默多效生长因子表达及其生物学意义[J];癌症;2006年10期
2 张宏艳,李刚,宋三泰;Pleiotrophin研究进展[J];国外医学.遗传学分册;2005年02期
3 霍艳英;胡迎春;周乔丹;杨柳;张博;李刚;吴德昌;;多效生长因子(Pleiotrophin)基因沉默后的基因表达谱初步分析[J];中国生物化学与分子生物学报;2007年05期
4 方玲;胡迎春;杨柳;刘梦伊;刘昕;潘兴斌;吴德昌;霍艳英;;多效生长因子通过JNK信号通路负调控Schlafen2基因表达[J];中国生物化学与分子生物学报;2008年12期
5 高原,于吉人,郑树森;多向生长因子在胃癌生长转移中的作用[J];中华医学杂志;2001年08期
6 张敏,张新,白春学,陈杰,MinQ.Wei;RNA干扰技术抑制A549细胞表皮生长因子受体表达的研究[J];中华肿瘤杂志;2004年12期
7 安立峰,董震;RNA干扰——肿瘤研究的新工具[J];中华肿瘤杂志;2005年07期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李麟;宣亮;付党华;;一例大肠杆菌引起猪腹膜炎的诊治报道[J];安徽农业科学;2008年36期
2 任子利;赵彦玲;王建洲;李瑜鑫;强巴央宗;;西藏黄牛胎儿成纤维细胞的分离与培养[J];安徽农业科学;2011年24期
3 胡迎春;刘敏丽;李刚;霍艳英;吴德昌;;siRNA沉默多效生长因子表达及其生物学意义[J];癌症;2006年10期
4 唐素兰,赵芳芳,冯锡才,刘从森,李英欣;阴道炎患者假丝酵母菌、滴虫检验结果分析[J];蚌埠医学院学报;2004年04期
5 冯锡才,闵宏林,李英欣,唐素兰;溶脲脲原体两种培养方法比较[J];蚌埠医学院学报;2005年02期
6 黄谷良;林特夫;;细菌L型感染的意义和研究进展(二)[J];蚌埠医学院学报;2006年03期
7 金珍婧,迟宝荣;慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA水平变化及临床意义[J];吉林大学学报(医学版);2003年06期
8 郑静波;;超声雾化吸入在门诊的应用[J];包头医学;2008年03期
9 黎秋波;秦小莲;梁彤;张宁;;2011年玉林市妇幼保健院传染病院内疫情分析[J];包头医学;2012年02期
10 王立新,王革新,王大强;南阳市卧龙区2000-2003年麻疹流行病学分析[J];包头医学院学报;2005年01期
中国重要会议论文全文数据库 前5条
1 彭界;;中老年呼吸道疾病患者MP-IgM检测分析[A];第二十五届航天医学年会暨第八届航天护理年会论文汇编[C];2009年
2 张志宏;胡平;孙博;林德贵;;患外耳炎犬耳道中马拉色菌的分型及体外药敏实验[A];中国畜牧兽医学会2008年学术年会暨第六届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2008年
3 张惠霞;张晓春;王力宁;;肠道细菌易位的中西医研究概况[A];第23届全国中医儿科学术研讨会暨儿科名中医讲习班论文汇编[C];2006年
4 吴杰;虞坚尔;张新光;;中西医结合治疗小儿支原体肺炎临床观察[A];第25届全国中医儿科学术研讨会暨中医药高等教育儿科教学研究会会议学术论文集[C];2008年
5 姜良铎;焦扬;;调整阴阳与微生态平衡的治疗理念探讨[A];2009年中华中医药学会内科分会全国中医内科临床科学研究专题研讨会论文汇编[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 魏卓;肿瘤干细胞标志物usp22在人膀胱移行细胞癌中的表达及临床意义[D];华中科技大学;2011年
2 申培红;siRNA对乳腺癌特异性基因表达影响及与S100A4、ETS1、VEGF、CD105基因表达关系的研究[D];郑州大学;2011年
3 赵燕芳;5-羟基-1H-吲哚-3-羧酸乙酯类化合物的合成及抗病毒活性研究[D];沈阳药科大学;2004年
4 王迅;á干扰素诱导的细胞蛋白与乙型肝炎病毒相互作用关系的研究[D];复旦大学;2004年
5 邝枣园;肺炎衣原体对血管内皮细胞的损伤及黄芩苷的保护作用[D];广州中医药大学;2005年
6 杨晓燕;家鸭人工感染鸭瘟强毒株的动态分布、黏膜免疫及对肠道菌群结构的影响[D];四川农业大学;2006年
7 祝蓉;采用RNA干扰技术抑制上皮源性肿瘤细胞表皮生长因子受体表达及阻滞肿瘤细胞周期的实验研究[D];复旦大学;2007年
8 王成章;银杏叶聚戊烯醇(GP)的分离和衍生物合成机理及生物活性研究[D];中国林业科学研究院;2007年
9 赵维明;应用树枝状高分子载体靶向基因治疗前列腺癌的实验研究[D];天津医科大学;2007年
10 彭鑫;《伤寒论》阳明、太阴病证与肠道微生态及人体反应性关系研究[D];北京中医药大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 马荣德;禽波氏杆菌的生物学特性研究及血清分型的初步探索[D];山东农业大学;2010年
2 敏云馨;藏獒三种组织成纤维细胞系的构建及生物学研究[D];西北民族大学;2010年
3 孙英;露蜂房汤治疗扁平疣的临床疗效观察及其对患者IL-2、IL-4、γ-IFN水平的影响[D];山东中医药大学;2010年
4 严敏;银翘散对流感病毒感染小鼠模型肺组织mBDF1表达的影响[D];成都中医药大学;2010年
5 乔朋波;不同血清型副鸡嗜血杆菌差异的比较[D];河北农业大学;2011年
6 张景阁;金磁微粒纯化细菌基因组DNA方法的研究[D];西北大学;2011年
7 谭燕玲;鸡胚胎性疫病病原检测和禽波氏杆菌OMPA原核表达及免疫原性检测[D];山东农业大学;2011年
8 王文娟;食源性致病菌多重PCR检测试剂盒的研制与应用[D];山东农业大学;2011年
9 张春艳;152例EB病毒感染住院患儿的临床研究[D];吉林大学;2011年
10 陈春;携带大鼠Foxp3基因慢病毒载体的构建及慢病毒包装的研究[D];安徽医科大学;2011年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前3条
1 陈菊祥,卢亦成,唐榕,方雄英,夏放,廖建春,楼美清,付志仁,应康,谢毅,毛裕民;人PTN基因在脑胶质瘤、肝细胞癌、喉鳞癌中的表达研究[J];第二军医大学学报;2001年07期
2 张敏;RNA干扰的研究进展[J];国外医学(分子生物学分册);2003年01期
3 霍艳英;胡迎春;周乔丹;杨柳;张博;李刚;吴德昌;;多效生长因子(Pleiotrophin)基因沉默后的基因表达谱初步分析[J];中国生物化学与分子生物学报;2007年05期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 祖旭宇;蔡秋香;曹德良;廖端芳;;人类醛糖还原酶类似蛋白1 siRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定[J];南华大学学报(医学版);2009年05期
2 丁勇;范德刚;单乐群;王育才;杨彤涛;马保安;;Cyclin E分子siRNA慢病毒载体的构建及其对骨肉瘤细胞系Sosp9607的影响[J];科学技术与工程;2010年18期
3 张圆;方亮;张春梅;金伯泉;庄然;;CD226分子siRNA慢病毒载体的构建和鉴定[J];科学技术与工程;2010年13期
4 梁树辉,丁杰,黄大伟,潘阳林,林涛,党冬梅,时永全,吴开春;胃癌细胞AGS中KDR的表达对人脐静脉内皮细胞生物学行为的影响[J];现代肿瘤医学;2005年02期
5 倪勤;RNA干扰技术防治病毒性肝炎的研究[J];国外医学.流行病学.传染病学分册;2003年04期
6 李光明,谢青,史毅,李定国,金由辛;siRNA对HSC结缔组织生长因子的抑制作用[J];上海第二医科大学学报;2005年02期
7 郭海霞;李文益;徐令;苏浩彬;黎阳;夏焱;梁立阳;;慢病毒载体携带的VEGFR_2 shRNA对HL60的体外杀伤作用[J];中国病理生理杂志;2007年06期
8 李金东;孙梅;高楠;罗树生;王荣有;金成彦;张兴义;;siRNA-Med19对人肺癌A549细胞Med19转录、表达的影响[J];中国老年学杂志;2009年09期
9 燕春艳;RNA干扰技术研究进展[J];实用医药杂志;2003年09期
10 马鹏鹏,葛晔华,郭睿,马静,陈平,薛社普,韩代书;小分子干扰RNA(siRNA)表达载体沉默靶基因的研究[J];解剖学报;2004年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 邓清华;刘国文;刘磊;王建国;朱晓岩;李小兵;王哲;;siRNA特异性抑制犊牛原代肝细胞SREBP-1c基因的表达[A];中国畜牧兽医学会家畜内科学分会第七届代表大会暨学术研讨会论文集(上册)[C];2011年
2 季爱民;苏丹;车鸥;李文适;孙靓;张忠义;杨彬;;壳聚糖/siRNA纳米粒介导的功能性基因沉默研究(英文)[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
3 黄伟;吕明;金明姬;杨长青;高钟镐;;mPEG-PCL-g-PEI聚合物的合成及其siRNA递送性能[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
4 陈宇;郑海涛;杨力建;陈少华;沈琦;刘思初;李萡;李扬秋;;靶向抑制PPP2R5C基因的siRNA的筛选[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年
5 刘政;邱广斌;;MYCT-1基因特异的siRNA对GES-1细胞凋亡、增殖及细胞周期的影响[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
6 陈卫华;王跃闽;;Cb1-b特异性siRNA载体的筛选验证[A];华东六省一市泌尿外科学术年会暨2011年浙江省泌尿外科、男科学学术年会论文汇编[C];2011年
7 刘芳蕾;周勇;应可净;;肺癌PLK1基因多态性及siRNA干预的研究[A];2011年第三十三届浙江省呼吸系病学术年会暨呼吸疾病诊治新进展学习班论文汇编[C];2011年
8 薛利军;曹明媚;秦照玲;潘欣;戚中田;;siRNA抑制结核分枝杆菌侵袭相关基因mcela在体外培养的人细胞内的表达[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年
9 章如新;;P物质siRNA在变应性鼻炎中的作用机制研究[A];世界中联耳鼻喉口腔专业委员会换届大会及第三次学术年会暨中华中医药学会耳鼻喉科分会第十七次学术交流会暨广东省中医及中西医结合学会耳鼻喉科学术交流会论文汇编[C];2011年
10 李平;刘苹;陈星云;赵艳;彭艳;陈磊;周元国;;大鼠c-ski基因siRNA真核表达载体的构建及其在成纤维细胞中的干扰效果观察[A];重庆市生物化学与分子生物学学术会议论文摘要汇编[C];2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 余志平;打开功能基因组学与未来治疗学的大门[N];中国医药报;2004年
2 庄北宁;防治非典,专家称找到基因“新药”[N];新华每日电讯;2005年
3 中国移动通信集团湖北有限公司 魏涛;OTN与PTN联手搭建高效安全的下一代传送网[N];人民邮电;2010年
4 烽火通信科技股份有限公司 金家德;规模应用推动PTN产业化[N];人民邮电;2010年
5 杨霞;防治SARS药研发获阶段性成果[N];中国医药报;2004年
6 特约记者 刘文;广东移动PTN网关解决互通问题[N];通信产业报;2010年
7 高辰;PTN商用时机已成熟[N];人民邮电;2011年
8 烽火科技;烽火科技PTN助力3G网络建设[N];通信产业报;2009年
9 朱宁;上海贝尔领先技术和强大实力支持PTN规模部署[N];人民邮电;2009年
10 本报记者 于尚民;中兴通讯:PTN有望夺魁中移动首标[N];通信产业报;2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 余勇;针对PTN重组慢病毒介导的siRNA技术在小细胞肺癌基因治疗中的实验研究[D];苏州大学;2010年
2 俞晓岚;过表达CXCR4的骨髓间质干细胞移植治疗大鼠脑梗死的疗效观察[D];福建医科大学;2010年
3 韦烨;基因改造骨髓造血干细胞靶向抑制结直肠癌新生血管形成的实验研究[D];复旦大学;2010年
4 刘瑜;BTBD10在人脑胶质瘤中的表达及其对U251细胞株增殖和凋亡的影响[D];第二军医大学;2010年
5 林恒;线粒体转录因子A在重组人肝再生增强因子对梗阻性黄疸大鼠肝功能保护中的作用机制研究[D];第三军医大学;2009年
6 张金平;αv和β_1整合素通过FAK信号通路介导了Aβ对海马神经元的神经毒性作用[D];华中科技大学;2011年
7 林文平;脑红蛋白基因修饰的骨髓间充质干细胞对兔脊髓损伤保护作用的实验研究[D];福建医科大学;2011年
8 朱震坤;热休克蛋白27在头颈部鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭中的作用研究[D];山东大学;2010年
9 王鹏;依赖p53的癌基因Wip1在人脑胶质瘤细胞恶性增殖机制中的作用研究[D];华中科技大学;2010年
10 吕学军;Caveolin-1在LPS诱导AT-1细胞和小鼠肺部急性损伤中的作用及机制研究[D];第三军医大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 黄万刚;c-Met基因siRNA慢病毒表达载体的构建及其稳定转染细胞株的筛选[D];河北医科大学;2011年
2 陈鹏;靶向SMAD3基因的siRNA筛选及其慢病毒载体的构建[D];泸州医学院;2010年
3 盛鹏程;绵羊Myostatin基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定[D];山东农业大学;2011年
4 魏衍全;慢病毒介导shRNA稳定持续抑制口蹄疫病毒增殖的两类细胞系的建立[D];中国农业科学院;2011年
5 马贵亮;慢病毒载体介导的TNF-α基因在脐血间充质干细胞中的表达的实验研究[D];青岛大学;2010年
6 栾冲;可诱导表达hBMP-2基因的慢病毒载体的构建及其慢病毒的产生和鉴定[D];青岛大学;2010年
7 陈豪;乙肝病毒X基因(HBVX)慢病毒载体的构建和鉴定[D];福建医科大学;2011年
8 张国峰;慢病毒载体介导的RNAi抑制牛整联蛋白亚基αv基因表达的研究[D];中国农业科学院;2011年
9 陈春;携带大鼠Foxp3基因慢病毒载体的构建及慢病毒包装的研究[D];安徽医科大学;2011年
10 沈上杭;短发夹RNA抑制缺氧诱导因子-1α表达对脑胶质瘤细胞增殖、侵袭及转移的影响[D];福建医科大学;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026