收藏本站
《苏州大学》 2011年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

干细胞样脑胶质瘤细胞株的建立及CD40信号对肿瘤干细胞生物学行为的作用机制

葛彦  
【摘要】:肿瘤干细胞是指癌瘤组织中少量存在的具有自我更新能力和分化潜能的肿瘤细胞亚群,是肿瘤发生发展、复发和转移的根源,也是进行肿瘤的诊断和治疗的新型靶点。鉴此,探讨肿瘤干细胞生物学特性并深入理解其内在机制具有极其重要的意义。 脑胶质瘤是常见的恶性疾病,呈侵袭性生长,易复发、预后差。脑胶质瘤干细胞可能通过高度的侵袭、迁移能力和促进肿瘤微血管生成及耐药等机制参与肿瘤的恶性生物学行为。目前肿瘤干细胞的获得主要是从手术切除的肿瘤标本中分选CD133+细胞群或利用现有常规胶质瘤细胞株诱导神经干细胞球,富集肿瘤干细胞。前者操作复杂,个体差异性大;而后者CD133阳性细胞比例均在2%以下。因此,建立稳定的干细胞样脑胶质瘤细胞株获得细胞模型,在体内外进行肿瘤干细胞研究具有重要的意义。 肿瘤微环境是指肿瘤所处的内环境,由肿瘤细胞、肿瘤周围的成纤维细胞、免疫和炎性细胞、以及多种细胞因子等共同组成。在肿瘤病理过程中,肿瘤环境对肿瘤细胞进行塑型,使其有利于肿瘤生长、粘附、侵袭、转移;肿瘤细胞也对所处微环境进行适应和改造。因此,肿瘤细胞与肿瘤微环境之间相互作用、相互影响,贯穿于肿瘤发生和发展全过程,并影响着肿瘤的病程和转归。 作为肿瘤病理过程中关键的细胞亚群——肿瘤干细胞是如何受到肿瘤微环境的调节,又是如何适应和对肿瘤微环境进行塑型?针对这一问题的深入探讨有助于我们理解肿瘤病理机制和靶向肿瘤干细胞进行肿瘤的诊断和治疗。 鉴此,本研究选择脑胶质瘤为研究对象,通过建立干细胞样脑胶质瘤细胞株作为体内外研究膜型,进而选择肿瘤微环境中重要的炎性因子介导的信号:CD40和IL-6信号为切入点,探讨肿瘤微环境炎性信号对肿瘤干细胞生长、迁移、和血管生成等恶性生物学行为的作用及机理。 一、干细胞样脑胶质瘤细胞株的建立及其生物学特性分析 【目的】建立干细胞样脑胶质瘤细胞株,并对其生物学特性进行体内外研究。 【方法】从高度恶性胶母细胞瘤患者肿瘤组织中分离肿瘤细胞并进行体外长期培养建株,进而从肿瘤干细胞标志物表达、染色体核型分析、生长特性、侵袭性、耐药性、成瘤性等肿瘤干细胞典型特征对这株细胞进行生物学特性鉴定。 【结果】①经体外长期传代获得性质稳定的细胞株,命名为G1335。②G1335细胞在无血清培养基中呈神经球样生长;在含血清的常规培养条件下,细胞逐渐分化、贴壁生长,呈现出胶质瘤细胞的典型形态。③细胞组织化学染色显示,G1335细胞表达神经干细胞标志Nestin、肿瘤干细胞标志CD133和星形胶质细胞标志物胶质酸性蛋白GFAP。④染色体高度突变,呈现出典型的肿瘤细胞核型。⑤耐药性实验显示,G1335细胞与其它胶质瘤细胞株相比,具有化疗耐受性。⑥裸鼠体内成瘤的实验显示,3×10~4的G1335细胞仅10d左右就能形成肿瘤,呈高致瘤性。 【结论】G1335细胞是一株稳定的干细胞样脑胶质瘤细胞株,可以用作脑胶质瘤干细胞体内外研究理想的细胞模型。 二、肿瘤微环境因素对G1335细胞表达CD40分子的影响 【目的】利用干细胞样脑胶质瘤细胞株G1335为细胞模型,体外模拟缺氧和炎症环境等肿瘤微环境因素,探讨对肿瘤干细胞表达协同刺激分子CD40的影响。 【方法】利用FCM、RT-PCR等多种方法检测G1335细胞CD40分子和gp130的表达。进而采用细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6单独或联合缺氧条件培养,检测膜CD40、gp130表达的变化,及其相互调节关系。 【结果】①缺氧能明显上调G1335细胞IL-6受体gp130的表达。②细胞因子IFN-γ,TNF-α和IL-6能持续上调G1335细胞膜CD40表达。③IL-6联合缺氧培养可明显上调G1335膜CD40表达。 【结论】肿瘤微环境中缺氧和细胞因子的刺激可上调G1335细胞表达CD40分子,使得CD40-IL-6/gp130信号形成正反馈环路,彼此相互促进。因此,肿瘤微环境因素上调肿瘤干细胞CD40的表达可能是肿瘤微环境作用于肿瘤干细胞的重要途径。 三、CD40信号对G1335细胞生物学行为的作用及机制 【目的】探讨CD40信号对脑胶质瘤干细胞的增殖、侵袭、粘附、促血管生成以及化疗耐受等生物学行为的作用及其分子机制。 【方法】探讨sCD40L对G1335细胞的促增殖效应。采用ELISA法、ICC、FCM检测sCD40L激发CD40信号对G1335细胞因子IL-6、VEGF分泌及趋化因子受体CXCR4表达的影响。Transwell、克隆形成实验研究IL-6对肿瘤干细胞体外迁移、神经球形成的作用。利用FCM、ICC检测CD40信号激发后,肿瘤干细胞表面负性调控分子TGF-β、PD-L1、B7H4表达及重要细胞因子TGF-β、IL-10、VEGF、IL-6表达的调控。采用裸鼠成瘤实验证CD40信号对裸鼠的致瘤作用。 【结果】①CD40信号促进G1335细胞体外增殖。②ELISA和ICC表明CD40信号促进G1335细胞分泌细胞因子VEGF、IL-6。③IL-6信号上调G1335细胞膜CXCR4表达,促进G1335迁移能力。④IL-6信号促进G1335细胞形成神经球,维持自我更新。⑤CD40信号能明显上调G1335细胞膜型TGF-β、PD-L1表达,促进TGF-β分泌。⑥裸鼠成瘤实验显示,与对照组相比,sCD40L处理组G1335细胞在裸鼠体内成瘤所需细胞数量少、成瘤时间短,肿瘤体积和血管密度增高。 【结论】肿瘤微环境因素通过激发CD40及其下游信号,促进肿瘤干细胞生长、迁移、和血管生成等恶性生物学行为;而肿瘤干细胞可能在CD40信号的作用下,通过上调负性共刺激分子和负性细胞因子分泌对所在肿瘤微环境进行适应和塑型。
【学位授予单位】:

知网文化
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978