壳寡糖促外周神经损伤修复及作用机制初探

【摘要】：目的：观察壳寡糖促坐骨神经损伤后修复作用，并探讨其作用机制。 第一部分壳寡糖促坐骨神经损伤修复作用的研究 方法： 1.制备大鼠坐骨神经损伤模型：SD大鼠40只，雌雄各半，行左侧坐骨神经夹伤术。术后，随机分为4组：壳寡糖低、高剂量组（剂量分别为：3、6mg/kg），弥可保组（阳性对照，剂量为：130μg/kg），及对照组（给予等体积的生理盐水）。腹腔注射给药，每天一次，共21天。 2.检测大鼠术后4、8、12、16天热刺激撤回反射(WRL)。 3.分别于术后8、12、16、20天行足迹实验，计算坐骨神经功能指数（SFI）。 4.术后21天，所有大鼠行电生理学检测。记录复合肌动作电位(CMAPs)，计算CMAPs恢复指数（recovery index）。 5.术后21天，每组随机选取2只大鼠，处死后取损伤段坐骨神经，固定、包埋和电镜观察再生有髓神经纤维直径和髓鞘厚度。 6.术后21天，剩余各组大鼠经灌流固定，取双侧腓肠肌，计算腓肠肌湿重比；损伤侧腓肠肌，进行石蜡包埋、切片，HE染色后测定肌纤维横截面积（CSA）。 7.取损伤段坐骨神经，行NF-200免疫组织化学染色，检测再生神经纤维形态和再生神经纤维数。 结果： 1. WRL结果显示：4组所有大鼠在术后第4天，WRL值之间没有显著性差异（P0.05）。壳寡糖高剂量组在术后的第8、12天的WRL值显著低于对照组（P0.05）。 2. SFI结果显示：4个实验组的SFI值在术后第8天，没有显著性差异（P0.05）。壳寡糖低、高剂量组在术后第16、20天的SFI值均显著高于对照组（P0.05）。 3.电生理学检测结果显示：壳寡糖高剂量组的大鼠坐骨神经夹伤处近侧段和远侧段的复合肌动作电位恢复指数均显著高于对照组（P0.05）。 4.腓肠肌湿重比结果显示：壳寡糖高剂量组的大鼠腓肠肌湿重比与对照组相比有显著性差异（P0.01）。 5.肌纤维横截面积结果显示：壳寡糖高剂量组的大鼠腓肠肌肌纤维CSA与对照组相比有显著性差异（P0.05）。 6. NF-200免疫组化结果显示：壳寡糖低、高剂量组大鼠坐骨神经损伤段平均再生神经纤维数显著高于对照组（P0.01）。 7.电镜结果显示：高剂量壳寡糖组大鼠坐骨神经夹伤段再生有髓神经纤维结构致密均匀，板层结构完整、清晰，板层数较多。壳寡糖高剂量组大鼠坐骨神经损伤段再生有髓神经纤维髓鞘平均厚度显著高于对照组（P0.01）。 第二部分壳寡糖促神经损伤修复作用机制的研究 （一）壳寡糖促神经元生长的作用 方法： 1.体外DRG植块培养和DRG神经元分离培养，通过NF-H免疫荧光细胞化学法观察在不同浓度壳寡糖（0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml）作用下植块培养的DRG和分离培养的DRG神经元生长情况。 2. Western blot方法检测不同浓度壳寡糖（0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml）对DRG神经元NF-H和GAP43蛋白表达的影响。 结果： 1. NF免疫组化结果显示：与对照组相比，中、高剂量壳寡糖（0.1mg/ml、0.2mg/ml）可以有效地促进DRG突起的生长（P0.01）。 2.壳寡糖对消化培养的DRG神经元突起生长的作用与其对DRG生长作用相似。与对照组相比，0.2mg/ml剂量壳寡糖可以有效地促进DRG神经元突起的生长（P0.05）。 3. Western blot检测结果显示：与对照组相比，0.2mg/ml高剂量壳寡糖组NF-H和GAP43的表达量显著增加（P0.05和P0.01）。 （二）壳寡糖对施万细胞活性和增殖的影响 方法： 1.体外原代培养大鼠施万细胞并纯化，免疫细胞化学荧光染色对细胞进行纯度鉴定。 2.采用MTT比色法，检测不同剂量壳寡糖（0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml）分别作用施万细胞24h和48h后，对细胞活力的影响。 3.采用Hoechst标记细胞核，分别观察计数不同剂量的壳寡糖（0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml）在不同时间（24h、48h）对细胞生长的影响，绘制生长曲线。 4.采用EdU标记和流式细胞仪分析方法，检测壳寡糖对施万细胞增殖的影响。 5.通过Western Blot方法，检测壳寡糖作用施万细胞后，对细胞中Cyclin D1、N-Cadherin和β-catenin表达的影响。 6.采用RNA干扰技术，进一步验证壳寡糖是否通过N-Cadherin来促进施万细胞的增殖。 结果： 1. S100免疫荧光细胞化学染色结果显示：培养的原代施万细胞纯度可达90%以上。 2. MTT结果显示：与对照组相比，1.0mg/ml壳寡糖作用施万细胞48h后能明显提高细胞活力（P0.05）。 3.生长曲线结果显示：与对照组相比，0.5mg/ml壳寡糖剂量组施万细胞数在48h时明显增多（P0.05），而1.0mg/ml壳寡糖剂量组施万细胞在作用24h和48h后，细胞数显著高于对照组（P0.05和P0.01）。 4.流式细胞仪分析结果显示：1.0mg/ml壳寡糖剂量组施万细胞的增殖指数显著高于对照组（P0.01）。 5. EdU标记结果显示：1.0mg/ml壳寡糖剂量组的EdU阳性细胞数的百分比显著高于对照组（P0.05）。 6. Western Blot结果显示：0.5mg/ml和1.0mg/ml壳寡糖剂量组施万细胞的CyclinD1和β-catenin的表达显著高于对照组（P0.05和P0.01）；1.0mg/ml壳寡糖剂量组的施万细胞中N-Cadherin的表达明显高于对照组（P0.05）。 7. N-Cadherin siRNA成功转染施万细胞后，N-Cadherin蛋白的表达明显降低（P0.05）。采用EdU染色检测壳寡糖对被转染后施万细胞增殖的影响，结果显示：N-Cadherin siRNA转染后EdU阳性细胞百分比明显下降（P0.05）。结果提示，壳寡糖通过N-Cadherin来促进施万细胞的增殖。 （三）壳寡糖促施万细胞成髓鞘的作用 方法： 1.采用施万细胞与DRG共培养模型，并通过MBP和MAG免疫荧光细胞化学法观察在壳寡糖作用下，对施万细胞成髓鞘的影响。 2. Western blot方法检测壳寡糖对DRG与施万细胞共培养中，对髓鞘形成相关蛋白MBP和MAG表达的影响。 结果： 1. MBP和MAG免疫组化结果显示：壳寡糖可促进施万细胞成髓鞘，壳寡糖组的MBP和MAG免疫阳性的髓鞘节段数高于对照组（P0.05和P0.01）。 2. Western blot检测结果显示：与对照组相比，0.2mg/ml壳寡糖可明显促进DRG与施万细胞共培养中MBP和MAG的表达（P0.05和P0.01）。 结论： 1.壳寡糖可促进坐骨神经损伤后修复及功能的恢复。 2.壳寡糖可促进DRG及其神经元的生长，和NF-H、GAP43的表达。 3.壳寡糖能提高施万细胞活力，促进其增殖，并提高细胞中Cyclin D1、N-Cadherin和β-catenin的表达，壳寡糖促施万细胞增殖可能与提高N-Cadherin的表达相关。 4.壳寡糖可促进施万细胞成髓鞘。