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PHBV改性及其作为软骨组织工程支架的研究

吴俊  
【摘要】:第一部分生物玻璃复合PHBV制备PHBV/BG支架 目的:将亲水性材料-生物玻璃(bioactive glass,BG)与聚(羟基丁酸酯-羟基戊酸酯)(poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate),PHBV)混合制备PHBV/BG复合材料,评价复合材料的亲水性、生物相容性及多孔支架材料的物理特征。方法:采用“剂浇铸-粒子析出法”将一定量(10%和20%质量百分比)的生物玻璃与PHBV混合后制备PHBV/10%BG和PHBV/20%BG三维多孔支架材料及片状材料,通过静态水接触角法和吸水率检测并比较单纯PHBV及PHBV/生物玻璃复合材料的亲水性;通过细胞粘附率检测及扫描电镜观察细胞在支架材料的生长情况评价支架的生物相容性。扫描电镜观察PHBV及PHBV/生物玻璃支架多孔结构并检测材料的弹性模量。结果:PHBV分别与10%BG和20%BG复合后,复合材料的孔径、孔隙率与单纯PHBV相比无明显差异。水接触角从65±1.3°降低至52±2.5°和32±1.5°,弹性模量从0.16±0.03MPa增加到0.22±0.09MPa、0.41±0.09MPa,差异均有统计学意义(P<0.01)。与单纯PHBV相比,细胞在复合材料上的粘附率明显提高,并随着复合材料中BG含量的增加而增加。扫描电镜观察示细胞在支架上粘附良好。结论: BG与PHBV复合可以改善PHBV材料的的亲水性,提高材料对细胞的粘附能力及力学性能。PHBV/BG复合支架具有良好的生物相容性和多孔支架结构。 第二部分PHBV/BG复合软骨细胞构建组织工程化软骨 目的:将软骨细胞接种到PHBV和PHBV/20%BG和支架上,体外培养后植入裸鼠皮下培养,观察期体内成软骨能力,评价PHBV/20%BG作为软骨组织工程支架材料的可行性。方法:将荧光标记的软骨细胞分别接种至PHBV和PHBV/20%BG支架上,培养4h和12h后荧光显微镜观察细胞在支架上的分布情况。将PHBV和PHBV/20%BG制成浸提液培养软骨细胞,并行CCK检测细胞增殖情况。将软骨细胞接种到PHBV和PHBV/20%BG支架上分别作为对照组和实验组,体外培养1周、2周、3周后行软骨细胞DNA定量检测。将体外培养3周的细胞-支架复合物移植到裸鼠皮下继续培养,至4周,8周,12周取材行组织学染色,细胞外基质成分(胶原、GAG)定量检测及弹性模量测定。结果:荧光显微镜观察显示与PHBV支架相比,软骨细胞接种至PHBV/20%BG支架后向支架内部迁徙的速度更快,在支架内部分布的更为均匀。CCK检测显示经PHBV/20%BG浸提液培养的软骨细胞增殖速度更快。体外培养期间,实验组新生组织软骨细胞DNA含量较对照组明显更多,且实验组裸鼠皮下培养新生组织在支架内分布更为均匀,厚度更厚,软骨结构更为成熟,且细胞外基质成分(胶原、GAG)含量和弹性模量更高。结论:BG与PHBV复合有利于软骨细胞在支架内均匀分布及增殖,与PHBV相比,以PHBV/20%BG为支架构建的组织工程化软骨质量更好。 第三部分骨髓间充质干细胞的诱导分化以及与软骨细胞隔离共培养 目的:体外分离培养骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)并通过添加诱导剂或与软骨细胞隔离共培养两种方式,诱导BMSCs向软骨细胞分化。方法:抽取兔髂骨骨髓后采用密度梯度离心法分离培养BMSCs并在光镜下观察,采用抗兔CD29、CD105、CD166单克隆抗体行流式细胞仪检测鉴定。取原代及传代BMSCs贴壁培养,采用CCK检测细胞增殖并绘制生长曲线。使用软骨细胞诱导剂、成骨诱导剂量及脂肪诱导剂诱导BMSCs三相分化,并行相应的组织学染色及RT-PCR检测。将BMSCs与PLA/PGA支架复合后置于transwell室内,分别放于含有DMEM培养液(对照组)和贴壁软骨细胞(实验组)的培养皿内培养8周,植入裸鼠皮下继续培养6周,行RT-PCR检测和组织学染色。结果:骨髓采用密度梯度离心法分离获得细胞,第2代细胞CD29、CD105、CD166的阳性率分别为为70%±10%、77%±8%、45%±8%。经软骨化、骨化及脂肪化诱导后,相应的特异性染色均呈阳性,RT-PCR检测分别有Ⅱ型胶原、Ⅰ型胶原及aP2基因的表达。BMSCs-支架复合物与软骨细胞体外隔离共培养后有新生软骨样组织形成,RT-PCR检测显示基质含有Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。裸鼠皮下培养6周后实验组可以形成良好的软骨样组织,组织学染色示新生组织有软骨陷窝结构,基质富含GAG和Ⅱ型胶原,对照组新生组织皱缩,无软骨样组织形成。结论:密度梯度离心法可以获得纯度较好的BMSCs,添加软骨化诱导剂及与软骨细胞隔离共培养的方式均能够诱导BMSCs向软骨细胞分化。 第四部分PHBV/BG复合BMSCs修复兔关节软骨缺损的实验研究 目的:研究PHBV/20%BG支架复合BMSCs修复兔膝关节软骨缺损的效果,探讨PHBV/20%BG作为软骨组织工程支架的可行性。方法:分离培养兔自体BMSCs后接种至PHBV/20%BG支架体外培养3天。将20只健康新西兰大白兔的20个膝关节随机分为A组、B组、C组,每组10个膝关节(B组和C组共用1个关节)。于股骨髁关节面非负重区制作软骨缺损模型,缺损直径5mm、深度3mm。A组植入BMSCs-PHBV/20%BG复合物,B组关节缺损处植入PHBV/20%BG支架,C组为空白组不作处理。术后12周观察软骨缺损区的修复情况,缺损区组织分别取材行组织学染色和Ⅱ型胶原PCR检测。结果:A组关节软骨缺损区被新生软骨样组织填充修复,关节面基本平整,并与周围软骨组织整合良好。组织学染色及PCR检测示新生组织有软骨陷窝形成,细胞外基质为GAG和Ⅱ型胶原。B组和C组软骨缺损未被修复,软骨缺损处为纤维组织填充。结论:PHBV/20%BG支架复合BMSCs后移植至关节软骨缺损区有新生软骨形成,软骨缺损修复良好,PHBV/20%BG支架可以作为软骨组织工程支架材料。


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