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《苏州大学》 2015年
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用精胺修饰家蚕丝素及其作为基因传递载体

李静  
【摘要】:促进三维支架内血管网络的生成是引导皮肤真皮组织再生的关键问题。血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素(Ang-1)是两种最重要的是仅以血管内皮细胞为靶细胞的促血管再生生长因子,但生长因子的半衰期短。寻找合适的载体将生长因子的基因包被、压缩后,载入真皮再生支架内,使外源性基因原位转染细胞,细胞稳定、高效地表达相应的促血管生长因子,刺激血管的再生,是加快真皮再生支架内血管网络的生成速度、促进真皮组织再生的途径。家蚕丝素蛋白(BSF)具有良好的生物相容性,可被生物降解性,含有一定数量的极性氨基酸残基可以作为化学反应活性位点,通过化学修饰使其表面带负电荷翻转成带正电荷,可能作为促血管再生因子的基因载体,用于促进真皮再生支架内的血管网络再生。本文用精胺对丝素蛋白化学修饰,使丝素蛋白表面带负电荷翻转为正电荷,建立丝素蛋白的阳离子化技术;然后用阳离子化丝素蛋白(CMBSF)和聚乙烯亚胺(PEI)联合包被含VEGF和Ang-1编码的质粒基因(p DNA)形成复合物,保护、压缩p DNA并使其表面带正电荷,建立VEGF165-Ang-1双基因共表达质粒的传递载体新技术。在体外,一方面转染EA.hy926细胞,研究包被p DNA的方式对基因转染效果和细胞毒性的影响;另一方面,将复合物装载在丝素支架内,通过鸡胚绒毛尿囊膜血管形成实验,研究包被p DNA的方式对转染内皮细胞的效果,促进血管网络生成的影响。在体内,将质粒复合物装载在多孔丝素支架内后,植入SD大鼠背部真皮缺损创面,研究载体内p DNA是否能够原位转染创面细胞,促进丝素支架内血管网络的形成、促进创面真皮组织的再生。首先,精胺对家蚕丝素蛋白阳离子化改性,由碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活家蚕丝素蛋白侧链上的-COOH,可以将带正电荷的精胺上偶合于丝素蛋白的侧链。经精胺修饰的丝素蛋白表面的zeta电位由负值变为正值,其等电点由4.20变为9.04。其次,探究包被p DNA的方式对EA.hy926细胞体外转染的影响,通过激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜观察发现与PEI/p DNA复合物相比,(CMBSF+PEI)/p DNA和CMBSF/BSF/PEI/p DNA复合物对EA.hy926细胞的转染(24h)明显较好,且细胞的形态变好,细胞核缩现象明显减弱,CCK-8试剂测试细胞活力提高。此外研究(CMBSF+PEI)/p DNA和CMBSF/BSF/PEI/p DNA复合物对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的作用,通过图片观察得出,与空白丝素支架组、PEI/p DNA组相比,装载(CMBSF+PEI)/p DNA和CMBSF/BSF/PEI/p DNA复合物的多孔丝素蛋白支架上布满了丰满旺盛的血管,血管呈现放射叶脉状,通过Image-Pro Plus软件分析支架内的血管新生面积率明显增多。最后,装载VEGF165-Ang-1p DNA复合物对真皮再生支架血管生成的影响,通过组织学观察和Image-Pro Plus图像分析软件得出,在植入体内1周时,与空白支架组相比,含质粒复合物的支丝素架上新生组织率、促血管生长因子的阳性表达率没有显著性差异;而在植入体内2周时,与空白支架组相比,含质粒复合物的支架上新生组织率、新生微血管密度和VEGF、Ang-1和PDGF生长因子的阳性表达率均有显著性差异;在植入体内4周时,含质粒复合物的支架上新生组织率明显提高,胶原纤维化,而新生微血管密度和VEGF、Ang-1和PDGF生长因子的阳性表达率均明显减少,丝素支架基本上降解,新生组织几乎填充丝素支架的空隙结构。说明含质粒复合物的支架植入体内有利于新生血管、新生组织的生长,加快真皮缺损部位的修复。本文首次用精胺对家蚕丝素蛋白化学修饰,使丝素蛋白阳离子化。系统地探究(CMBSF+PEI)/p DNA复合物和CMBSF/BSF/PEI/p DNA复合物分别对EA.hy926细胞转染情况和细胞毒性的影响,首次研究将这两类含VEGF165-Ang-1双基因复合物装载在多孔丝素支架上对细胞转染的情况、促血管的生长及真皮组织缺损修复的影响。研究得出(10μg CMBSF+5μg PEI)/2μg p DNA复合物和20μg CMBSF/150μg BSF/10μg PEI/2μg p DNA复合物为最佳参数质量比,它们的细胞转染效果很好,细胞毒性减低,在鸡胚绒毛尿囊膜、植入SD大鼠背部实验中对新生血管、新生组织的生长有显著性影响。
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:TQ936;R318.08

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