Nrf2/ARE抗氧化信号通路活化在神经胶质细胞介导的神经保护中的作用

【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一种与年龄相关的神经退行性疾病,目前对帕金森病(PD)还缺乏有效的治疗手段,临床多以对症治疗来改善症状。这些治疗无法阻止PD病情发展,随着时间的推移症状会逐渐加重。治疗手段的缺乏反映的是我们对机制的了解还不够深入,因此对PD发病和病情发展的机制研究至关重要。神经胶质细胞的作用,特别是星形胶质细胞的抗氧化作用在PD的发生发展中具有重要的意义。此外,很多研究也表明Nrf2 (NF-E2-related factor 2)是细胞氧化应激反应中的关键因子,Nrf2/ARE抗氧化信号通路在神经系统疾病中有重要的神经保护作用。本实验研究Nrf2在PD大鼠模型中的表达情况和使用Nrf2/ARE信号通路的激动剂CDDO-Me对PD模型果蝇和大鼠的神经退行性的改善情况,以及在PD果蝇模型中分别在神经元和神经胶质细胞中过表达Nrf2后对神经退行性的改善情况,进而探讨星形胶质细胞中Nrf2/ARE信号通路在PD中神经保护作用。目的：建立PD大鼠模型,探讨脑组织中Nrf2和下游靶基因的表达情况,在PD果蝇模型中,Nrf2/ARE信号通路的激动剂CDDO-Me对PD模型果蝇和大鼠的神经退行性的改善情况,以及在PD果蝇模型中分别在神经元和神经胶质细胞中过表达Nrf2后对神经退行性的改善情况,研究该通路对PD动物模型的影响。方法：使用SD大鼠进行脑立体定位分别注射6-OHDA和6-OHDA+CDDO-Me构建PD模型,应用Western blot检测Nrf2在大脑纹状体和黑质中的表达变化,应用免疫荧光化学法观察Nrf2在黑质中细胞定位情况。通过转基因技术构建突变型α-Synuclein转基因PD果蝇模型,通过食物中给药建立鱼藤酮PD模型,给α-Synuclein转基因PD果蝇喂食Nrf2/ARE信号通路激动剂CDDO-Me,观察果蝇的生命周期和活动能力的变化情况,应用Western blot检测Nrf2的表达变化,通过外源基因的定位表达GAL4/UAS系统使Nrf2分别在神经元和神经胶质细胞中过表达,观察果蝇的生命周期和活动能力的改善情况,应用Western blot检测Nrf2的表达变化。结果：(1) 6-OHDA毁损后2周PD大鼠出现明显的典型旋转行为,TH免疫荧光染色显示PD模型大鼠毁损侧黑质致密部多巴胺神经元数量锐减。(2) Western blot结果显示,Nrf2在6-OHDA和6-OHDA+CDDO-Me处理的大鼠纹状体和黑质中表达水平比正常大鼠高,GCLC蛋白在纹状体中表达水平比正常大鼠高,但在黑质中表达水平比正常大鼠低。(3)免疫荧光结果显示,正常大鼠黑质中Nr-2主要表达在神经元内,星形胶质细胞中很少表达,而在PD大鼠黑质中Nrf2主要表达在星形胶质细胞中。(4) α-Synuclein转基因PD果蝇在使用激动剂CDDO-Me后观察到果蝇的生命周期延长,运动能力得到改善,Western blot结果显示Nrf2和GCLC蛋白的表达量增加,通过外源基因的定位表达GAL4/UAS系统使Nrf2分别在神经元和神经胶质细胞中过表达后,观察到同样的改善情况,且在胶质细胞中过表达Nrf2基因显示了比神经元中过表达Nrf2更高的生物学活性。其更高地抑制突变α-Synuclein的神经退行性改变。(5)在鱼藤酮建立的PD果蝇模型中,通过外源基因的定位表达GAL4/UAS系统使Nrf2分别在神经元和神经胶质细胞中过表达,观察结果显示,可以有效延长PD果蝇的寿命,改善其运动能力。结论：Nrf2和GCLC蛋白在正常大鼠和PD大鼠中的表达变化提示,Nrf2/ARE信号通路在PD的发生发展过程中得到活化,且在PD大鼠中主要是星形胶质细胞中Nrf2/ARE信号通路得到活化。PD果蝇模型中,在胶质细胞中过表达Nrf2基因显示了比神经元中过表达Nrf2更高的生物学活性,而星形胶质细胞是神经胶质细胞中数量最多的,功能最广泛的细胞,且与神经元有密切的联系提示,星形胶质细胞内Nrf2/ARE信号通路的活化对PD的发病产生主要的神经保护作用,对寻找新的PD治疗靶点,防止PD的病情发展具有临床价值。