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《苏州大学》 2016年
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氡致肺支气管上皮细胞损伤中LncRNA-ErbB调节通路的改变

陈志海  
【摘要】:目的:建立氡染毒的动物和细胞模型,研究氡染毒对小鼠肺组织和人支气管上皮细胞的损伤效应,从表观遗传学角度,阐明长链非编码RNA (lncRNA)通过调控ErbB信号通路参与氡致肺支气管上皮细胞损伤的分子机制。方法:(1)小鼠染氡模型建立:BALB/c小鼠30只,分为对照组和2个染氡剂量组,置于多功能生态氡室慢性吸入染毒,累积染毒剂量分别为0,60和120工作水平月(Working level month, WLM)。HE染色观察小鼠肺部病理改变。Western Blot和免疫组化方法检测ErbB信号通路相关蛋白的表达。(2)细胞染氡模型建立:对人支气管上皮细胞(HBE)进行氡染毒,染氡的浓度为20000Bq/m3,染毒时间为20min/次,染毒3d后再重复1次,连续染毒2次后作为染毒第1代(Rn1),分别染氡5代(Rn5)和10代(Rn10)。CCK-8法测定生长曲线、平板克隆和细胞锚着独立生长实验检测细胞克隆形成能力、流式细胞仪检测细胞周期和ROS变化、生化法测定超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力,Western Blot和免疫组化方法检测ErbB信号通路相关蛋白的表达。(3)ErbB信号通路相关蛋白检测:采用Western Blot和免疫组化方法,检测氡染毒后ErbB信号通路相关蛋白,包括ErbB2、K-ras、C-abl和Mig6等的表达改变。(4)差异表达lncRNA筛选:采用生物芯片筛选小鼠染氡后出现的差异表达的lncRNA,然后进行靶基因预测并构建有关靶基因的相互作用网络。选择表达明显改变的lncRNA,用荧光原位杂交(FISH)方法进行细胞内荧光定位,依据NCBI数据库确定其碱基序列并预测其可能作用的蛋白分子。(5)基因沉默和双荧光素酶报告基因实验:在V79细胞中转染lncRNA的特异性沉默体(lncRNA Smart Silencer), Western Blot检测目的蛋白的表达。分别构建lncRNA及其靶基因两侧UTR端的含荧光素酶基因的质粒载体,通过检测转染后荧光素酶的活性验证作用靶点。结果:(1)氡染毒BALB/c小鼠肺组织HE染色结果显示,肺间质充血水肿,肺泡间隔增厚,炎细胞浸润和部分肺组织出现纤维化;免疫组化结果显示,ErbB2和K-ras的表达升高,而C-abl、Mig6和p73的表达下降。Western Blot结果显示ErbB2磷酸化水平增高,C-ab1、Mig6和K-ras蛋白表达与免疫组化检测结果一致。(2)人支气管上皮细胞染氡后,细胞生长加快,侵袭性增强,细胞中ROS和CAT增加,SOD酶活力下调,细胞周期S期比例增多,ErbB信号通路中ErbB2/磷酸化和K-ras表达上调,而C-abl和Mig6表达下调。(3)生物芯片筛选的结果,染氡小鼠肺组织中发生差异表达的IncRNA有1256条,其中表达上调的825条,表达下调的431条。通过GO和KEGG富集分析,发现这些差异表达的IncRNA大多参与ErbB信号通路调节。采用real-time PCR,对其中9个IncRNA进行定量验证,发现ELK1、FR146301、FR052959、n417375和XR 168810.1的表达与芯片筛选的结果一致,其中只有FR052959表达上调。(4) LncRNA_FR052959,用FISH荧光定位发现其在细胞核与细胞质均有分布,根据NCBI数据库确定其碱基序列并预测其可能作用的蛋白分子为ErbB信号通路中的C-abl。(5)特异性沉默体和双荧光素酶报告基因实验发现,IncRNA FR052959能显著抑制C-abl基因5'-UTR端活性,进而调控ErbB信号通路中C-abl的表达。氡染毒后该抑制作用降低。结论:1、建立了氡染毒小鼠及支气管上皮细胞损伤的模型。长期氡照射可导致细胞生长加快、细胞周期改变、氧化应激增加、细胞侵袭性增强等一系列细胞恶性转化特征。2、在上述过程中,ErbB信号通路的相关基因和蛋白表达发生了改变,其中原癌基因ErbB和K-ras的表达上调,负调控基因Mig6和C-abl的表达下调。提示ErbB信号通路参与了氡致细胞恶性转化的过程。3、筛选出了氡染毒后表达上调的非编码RNA lncRNA-FR052959,通过特异性沉默体以及双荧光素酶报告基因实验,发现其能显著抑制C-abl基因5'-UTR端活性,进而调控ErbB信号通路中C-abl的表达。氡染毒的细胞中该抑制作用降低,提示RNA lncRNA-FR052959通过ErbB信号通路参与了氡致细胞损伤的调节。实验结果为阐明氡致肺癌的表观遗传学机制提供了新的研究方向。
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R114

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