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《苏州大学》 2017年
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家蚕CncC/keap1-ARE通路的关键基因克隆及其功能分析

胡景生  
【摘要】:家蚕是重要的绢丝昆虫,也是鳞翅目模式昆虫。由于化学农药在农林业生产的广泛使用,经常导致桑园被污染,造成家蚕中毒,严重影响蚕丝业的健康发展。CncC/keap1-ARE是涉及昆虫抗氧化和解毒的重要信号通路,在果蝇和赤拟谷盗中已有研究报道,家蚕中还没有相关研究报道。本研究分别对家蚕CncC和keap1基因进行克隆,并分析其氨基酸序列,得到各个功能区基序的定位。通过进化树分析和多物种序列对比发现,CncC的Neh1基序在所有物种中表现出高度保守,Neh2在哺乳动物中的DLG基序,在鳞翅目昆虫被DMG基序所代替。通过序列分析得到keap1的Cullin3结合位点和与CncC识别的DGR区域,这两个位点与keap1调控CncC的泛素化降解有着重要的作用。转录表达特征分析表明,CncC和keap1均在一龄幼虫体内高表达,CncC和keap1在涉及生殖,代谢毒性和神经中枢等组织中表达较高。一龄蚕由于头和身体的比例最大,两个基因在神经系统中的高表达,可能是导致CncC和keap1在一龄蚕中高表达的主要原因。使用qRT-PCR检测辛硫磷处理24 hr后,CncC和keap1的转录水平显著上调29.664倍和25.479倍。对家蚕脂肪体的基因表达谱分析表明,抗氧化基因硫氧化还原蛋白还原酶和谷胱甘肽S-转移酶基因,分析上调了1.365倍、1.335倍、1.642倍和1.765倍。另外辛硫磷处理后,qRT-PCR检测脂肪体中过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、硫氧化还原蛋白还原酶(thioredoxin peroxidase,TPx)和谷胱甘肽S-转移酶Delta(glutathione S-transferase delta,GSTd)分别上调2.714倍、1.288倍、2.146倍和2.233倍,结果和转录组数据一致。测定了活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和过氧化氢(H_2O_2)的活性水平,分别上调1.598倍、1.946倍和1.506倍。同时检测受CncC调控的CYP450家族基因(cyp4m5、cyp6ab4、cyp4l6、cyp6ae2、cyp6a8、cyp9g3和cyp306)的转录水平发现,辛硫磷处理后,CYP450解毒酶基因均显著上调。结果表明,辛硫磷处理家蚕引起脂肪体发生氧化应激,CncC的表达上调,引起解毒酶和抗氧化酶基因转录水平的上调,可能和脂肪体代谢解毒的生理功能相关。纳米二氧化钛(TiO_2NPs)是一种重要的纳米生物材料,目前被广泛应用到生物学领域。已有研究表明TiO_2NPs能够有效减缓辛硫磷诱导家蚕的氧化应激。TiO_2 NPs处理能有效减轻有机磷农药对家蚕丝腺和神经组织的损伤。脂肪体是家蚕体内重要的代谢解毒器官,TiO_2 NPs处理是否会影响家蚕脂肪体对农药的代谢,还没有研究报道。本研究使用TiO_2 NPs处理的桑叶喂养五龄家蚕三天,再添加辛硫磷处理24hr(TiO_2NPs+辛硫磷处理组)发现SOD、CAT、GSTd转录水平较辛硫磷处理组降低,并且ROS、MDA和H_2O_2的含量水平也和正常水平相当。结果表明,TiO_2 NPs能缓解辛硫磷所造成的氧化应激。为了进一步阐明其作用机制,对TiO_2 NPs+辛硫磷处理组中P450家族基因的转录水平进行了检测,结果表明,cyp4m5、cyp6ab4、cyp6a8和cyp9g3在TiO_2 NPs+辛硫磷处理组的表达量分别增加了2.784倍、3.047倍、2.254倍和4.253倍,推测P450家族基因的高表达提高了脂肪体代谢辛硫磷的能力。TiO_2 NPs能够诱导家蚕脂肪体的部分抗氧化基因的表达显著上调,缓解辛硫磷造成的过氧化物积累现象。同时TiO_2 NPs处理能够有效缓解辛硫磷中毒对家蚕机体造成的氧化应激。本研究克隆了CncC和keap1基因的全长序列,分析了两个基因的基本功能结构域。使用辛硫磷处理发现,家蚕脂肪体受到氧化应激会诱导CncC过表达,然后引起受CncC调控的下游解毒酶基因和抗氧化基因的表达。而TiO_2 NPs预处理能够有效缓解辛硫磷造成的家蚕脂肪体氧化应激。阐明了家蚕脂肪体受到外界诱导因子影响,CncC/keap1信号通路的调控机制。
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S881.2

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1 胡景生;家蚕CncC/keap1-ARE通路的关键基因克隆及其功能分析[D];苏州大学;2017年
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